| 研究課題/領域番号 |
18H01802
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| 研究機関 | 早稲田大学 |
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研究代表者 |
木野 邦器 早稲田大学, 理工学術院, 教授 (60318764)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 可逆的脱炭酸酵素 / 炭酸固定酵素 / 芳香族モノカルボン酸 / プロトカテク酸 / 芳香族ジカルボン酸 / 4-ヒドロキシイソフタル酸 / 4-ヒドロキシ安息香酸 |
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| 研究実績の概要 |
脱炭素化社会の実現に貢献する革新的バイオプロセスの開発を目指して、可逆的脱炭酸酵素を利用した二酸化炭素の固定化による工業的に有用な芳香族カルボン酸製造技術の開発研究を推進した。
合成可能な芳香族カルボン酸の多様性を拡張することを目的として、これまで報告の無い芳香族モノカルボン酸への炭酸固定による芳香族ジカルボン酸合成活性を有する可逆的脱炭酸酵素の探索を検討した。テレフタル酸のような工業的に有用な芳香族ジカルボン酸は、ジアミノ化合物またはジヒドロキシ化合物と縮合させることで汎用性のあるポリアミドまたはポリエステルを合成できるためポリマー原料としての用途も大いに期待できる。
そこで、芳香族ジカルボン酸である4-ヒドロキシイソフタル酸 (4HIPA) を炭素源とする培地を用いて土壌からのスクリーニングを行った。その結果、4HIPAに対する可逆的脱炭酸活性を有する酵母Cystobasidium slooffiae HTK3を取得することができた。HTK3株の無細胞抽出液に対して4HIPA脱炭酸活性を指標として多段階のカラムクロマトグラフィーによる精製を行ったところ、約36 kDaの単一のタンパク質画分を得た。当該タンパク質画分のN末端配列解析によってその15残基を明らかにした。さらに、RACE法を用いて当該活性を示す酵素 (4HIDC) の遺伝子配列も明らかにした。この遺伝子配列を既知の可逆的脱炭酸酵素と比較したところ、その相同性は50%前後で、4HIDCは既知の可逆的脱炭酸酵素とは一次構造の異なる新規酵素であることを明らかにした。
一方、カルボキシ基導入位置がこれまでの芳香族モノカルボン酸と異なるプロトカテク酸に対して可逆的脱炭酸活性を有する微生物を保存株より見出した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
芳香族モノカルボン酸合成活性を有する可逆的脱炭酸酵素はこれまでに報告されているが、昨年度の成果である芳香族カルボン酸に炭酸を固定して芳香族ジカルボン酸に変換する酵素の発見は初めてである。具体的には、4-ヒドロキシイソフタル酸を唯一の炭素源とするスクリーニング培地を利用することで土壌より4-ヒドロキシ安息香酸から4-ヒドロキシイソフタル酸を合成する活性を有する微生物を初めて取得し、さらには当該活性を有する酵素ならびに遺伝子を同定することができたが、この結果は、本スクリーニング系の妥当性を示すものであり、当初の計画通り、可逆的脱炭酸酵素による合成可能な芳香族カルボン酸の多様性を拡張することができた。本手法ならびに今回取得した芳香族ジカルボン酸合成活性を有する微生物および当該酵素遺伝子の情報から、さらに新たな芳香族ジカルボン酸合成を可能とする新規酵素開発への道が拓かれたと考える。この結果の一部は、2019年日本農芸化学会大会において２演題の口頭発表につながった。
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| 今後の研究の推進方策 |
昨年度の大きな成果として、芳香族ジカルボン酸である4-ヒドロキシイソフタル酸 (4HIPA)を芳香族モノカルボン酸である4-ヒドロキシ安息香酸(4HBA)から合成可能な可逆的脱炭酸酵素(4HIDC)を初めて見出し、当該酵素ならびに遺伝子を明らかにしたことである。今後、4HIDCの基質特異性等の詳細な生化学的解析を行い、新規酵素に関する知見を整理し、新たな芳香族ジカルボン酸に対する可逆的脱炭酸酵素の探索につなげる。
一方、カルボキシ基導入位置がこれまでの芳香族モノカルボン酸と異なるプロトカテク酸に対して可逆的脱炭酸活性を有する微生物を研究室保存菌の放線菌から見出したが、当該活性を有する酵素はその特性からこれまで研究室で扱ってきた酵素とは異なるUbiX/UbiDファミリーの属する可逆的脱炭酸酵素と推測している。したがって、合成可能な芳香族カルボン酸の多様性をさらに拡張するために、UbiX/UbiDファミリーの酵素探索・活性評価が可能なシステムを大腸菌で構築する。
また、PETに代わるバイオ樹脂として注目されているポリエチレンフラノエートの原料となるフランジカルボン酸(FDCA)の生産を目的に、FDCAに対する脱炭酸酵素の探索を検討する。
その他に、これまでに取得したArthrobacter sp. K8株由来の可逆的オルセリン酸脱炭酸酵素 (OAD)やCupriavidus sp. TK株由来の6-メトキシサリチル酸脱炭酸酵素に関する基本的な酵素情報を明らかにして、論文として纏めて広報を行う。
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