高速原子間力顕微鏡で明らかにする微小管の構造欠陥によるキネシンの機能変調

2019 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 18H01837
• 研究機関: 名古屋大学
• 研究代表者: 内橋 貴之 名古屋大学, 理学研究科, 教授 (30326300)
• 研究期間 (年度): 2018-04-01 – 2021-03-31
• キーワード: 高速原子間力顕微鏡 / 微小管 / キネシン

研究実績の概要

I. 高速力学マッピング法の開発1)
高速AFMでイメージング中に任意の位置での定量機械特性を取得可能な”in-line-force-curve”法を開発した。この手法を用いてチューブリンが重合したタンパク質ポリマーである微小管の単一チューブリンダイマーの引き抜きによる局所構造操作に成功し、チューブリンダイマー間の結合エネルギーの定量化を行った。さらに、”in-line-force-curve”を拡張し、機械特性(弾性率・凝着力)を1フレーム3秒程度でマッピングできるシステムを開発した。
II.　屈曲微小管におけるキネシンの滑走運動：マイカ基板にアイランド上に平面脂質膜を形成し、さらに脂質膜を構成する正電荷脂質の量を制御することで、微小管を屈曲して基板に固定することができた。この微小管上で微小管関連運動タンパク質であるキネシンの滑走運動を高速AFMで観察した結果、微小管の変形が細胞内輸送に関与するの滑走速度を制御していることが明らかになった。屈曲の曲率が異なる微小管でのキネシンの移動速度を解析したところ、曲率が大きくなるほどキネシンの運動速度が低下した。分子動力学シミュレーションでキネシンの運動速度低下の要因を探ったところ、変形した微小管ではキネシンの親和性が高まっているためであることがわかった。この結果は、キネシンの移動を制御するためのメカノセンサーとしての微小管の役割を明らかにし、微小管の機械的変形がキネシンの移動を制御する役割を果たしていることを示唆している。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

インラインフォースモードを利用した微小管への点欠陥の形成とサイズ制御は効率よく行えるようになった。しかしながら、現状では微小管に形成した点欠陥周辺のキネシンの運動を高解像かつ安定に観察するまでには至っていない。さらに微小管の固定方法およびAFMの観察条件の最適化を検討する必要がある。一方で、本研究課題で開発したインラインフォースモードを基盤として、さらに機能向上することで、生体試料の硬さや探針との凝着力といった力学・化学特性をマッピングできる機能を開発することができた。この機能を活かすことで、微小管の局所力学特性がキネシンの移動運動に与える影響も調べることができると考えている。また、本研究の過程で、微小管に構造欠陥を形成せずとも、微小管の屈曲がキネシンの運動速度が変調されることが明らかになった。これは、微小管を構成するチューブリンの構造が微小管の屈曲によりわずかに変化し、その構造変化によってキネシンとの親和性が変化していることを意味しており、実際、分子動力学シミュレーションで屈曲によるチューブリンの構造変化によって屈曲した微小管とキネシンの親和性が高くなり、その結果、キネシンの運動速が低下していることを明らかにすることができた。これらの結果を踏まえて、次年度は微小管の構造欠陥とキネシンの運動活性の計測および解析を進めていく。

今後の研究の推進方策

インラインフォースカーブモードにより微小管に制御性良く欠陥を形成し、その欠陥周囲のでキネシンの運動解析を進める。具体的に以下の方法で実験を進める。
I. 微小管の局所ヌクレオチド状態の制御とキネシンの運動活性解析：微小管に生じた構造欠陥は周囲にあるフリーなチューブリンの結合により自己修復される。チューブリンはGTPの結合により重合するが、微小管中のチューブリンはGTP型とGDP型が混在した一種の状態欠陥を形成しており、それがキネシンの運動活性を変えるとの報告がある。微小管の自己修復機能を利用して、生成した欠陥にGDPあるいはGTP(GMPPCC)結合型のフリーなチューブリンで修復することで、微小管の局所的ヌクレオチド状態を制御する。アセチル化状態が異なるチューブリンでも同様の実験を行う。
２．微小管の局所欠陥によるキネシン-2の運動変調：モータータンパク質であるキネシン-2は微小管に欠陥があると速度の低下や微小管からの解離が起こることが報告されている。しかし、その際の欠陥とタンパク質の位置関係や速度低下の分子機構は明らかでない。前年度にチューブリンダイマー欠陥の数と位置を制御し、欠陥に遭遇したときのキネシンのふるまい、1) 欠陥からの距離と運動速度、2) プロトフィフィラメントの乗り換え運動、3) 欠陥のサイズに依存した運動速度低下と解離、4) 欠陥近傍でのキネシンの構造変化を解析し、構造・物性欠陥によるキネシンの運動変調の分子機構を明らかにする。

研究成果

• [雑誌論文] Recent advances in bioimaging with high-speed atomic force microscopy (2020)
  • 著者名/発表者名: Takayuki Uchihashi,Christian Ganser
  • 雑誌名: Biophysical Reviews 巻: 12 ページ: 363-369
  • DOI: 10.1007/s12551-020-00670-z
  • 査読あり
• [雑誌論文] Dynamics of oligomer and amyloid fibril formation by yeast prion Sup35 observed by high-speed atomic force microscopy (2020)
  • 著者名/発表者名: Hiroki Konno,Takahiro Watanabe-Nakayama,Takayuki Uchihashi,Momoko Okuda,Liwen Zhu,Noriyuki Kodera,Yousuke Kikuchi,Toshio Ando,Hideki Taguchi
  • 雑誌名: Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 巻: 117 ページ: 7831-7836
  • DOI: 10.1073/pnas.1916452117
  • 査読あり
• [雑誌論文] Crystal structure of heliorhodopsin. (2020)
  • 著者名/発表者名: Wataru Shihoya,Takayuki Uchihashi,Hideki Kandori,Osamu Nureki
  • 雑誌名: Nature 巻: 574 ページ: 132?-?136
  • DOI: 10.1038/s41586-019-1604-6
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Rad50 zinc hook functions as a constitutive dimerization module interchangeable with SMC hinge. (2020)
  • 著者名/発表者名: Hisashi Tatebe,Chew Theng Lim,Hiroki Konno,Kazuhiro Shiozaki,Akira Shinohara,Takayuki Uchihashi,Asako Furukohri
  • 雑誌名: Nature Communications 巻: 11 ページ: 370
  • DOI: 10.1038/s41467-019-14025-0
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Thermoresponsive Micellar Assembly Constructed from a Hexameric Hemoprotein Modified with Poly(N-isopropylacrylamide) toward an Artificial Light-Harvesting System. (2020)
  • 著者名/発表者名: Shota Hirayama,Koji Oohora,Takayuki Uchihashi,Takashi Hayashi
  • 雑誌名: Journal of the American Chemical Society 巻: 142 ページ: 1822?-?1831
  • DOI: 10.1021/jacs.9b10080
  • 査読あり
• [雑誌論文] Supramolecular tholos-like architecture constituted by archaeal proteins without functional annotation. (2020)
  • 著者名/発表者名: Maho Yagi-Utsumi,Arunima Sikdar,Chihong Song,Jimin Park,Rintaro Inoue,Hiroki Watanabe,Raymond N Burton-Smith,Toshiya Kozai,Tatsuya Suzuki,Atsuji Kodama,Kentaro Ishii,Hirokazu Yagi,Tadashi Satoh,Susumu Uchiyama,Takayuki Uchihashi,Keehyoung Joo,Jooyoung Lee,Masaaki Sugiyama,Kazuyoshi Murata,Koichi Kato
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 10 ページ: 1540
  • DOI: 10.1038/s41598-020-58371-2
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] High-speed near-field fluorescence microscopy combined with high-speed atomic force microscopy for biological studies. (2020)
  • 著者名/発表者名: Takayuki Umakoshi,Shingo Fukuda,Ryota Iino,Takayuki Uchihashi,Toshio Ando
  • 雑誌名: Biochimica et Biophysica acta. General subjects 巻: 1864 ページ: 129325
  • DOI: 10.1016/j.bbagen.2019.03.011
• [雑誌論文] Single-molecule imaging analysis reveals the mechanism of a high-catalytic-activity mutant of chitinase A from Serratia marcescens. (2020)
  • 著者名/発表者名: Akasit Visootsat,Akihiko Nakamura,Paul Vignon,Hiroki Watanabe,Takayuki Uchihashi,Ryota Iino
  • 雑誌名: The Journal of Biological Chemistry 巻: 295 ページ: 1915-1925
  • DOI: 10.1074/jbc.RA119.012078
  • 査読あり
• [雑誌論文] Non-Thermoresponsive Decanano‐sized Domains in Thermoresponsive Hydrogel Microspheres Revealed by Temperature‐Controlled High‐Speed Atomic Force Microscopy (2019)
  • 著者名/発表者名: Yuichiro Nishizawa,Shusuke Matsui,Kenji Urayama,Takuma Kureha,Mitsuhiro Shibayama,Takayuki Uchihashi,Daisuke Suzuki
  • 雑誌名: Angewandte Chemie International ed. 巻: 131 ページ: 8901-8905
  • DOI: 10.1002/ange.201903483
  • 査読あり
• [雑誌論文] Construction of a Hexameric Hemoprotein Sheet and Direct Observation of Dynamic Process of its Formation (2019)
  • 著者名/発表者名: Koji Oohora,Shota Hirayama,Takayuki Uchihashi,Takashi Hayashi
  • 雑誌名: Chemistry Letters 巻: 8 ページ: 186-190
  • DOI: 10.1246/cl.190855
• [雑誌論文] Hydrogel Microellipsoids that Form Robust String-Like Assemblies at the Air/Water Interface. (2019)
  • 著者名/発表者名: Kenshiro Honda,Yuka Sazuka,Kojiro Iizuka,Shusuke Matsui,Takayuki Uchihashi,Takuma Kureha,Mitsuhiro Shibayama,Takumi Watanabe,Daisuke Suzuki
  • 雑誌名: Angewandte Chemie International ed. 巻: 58 ページ: 7294?-?7298
  • DOI: 10.1002/anie.201901611
  • 査読あり
• [雑誌論文] Mutational and Combinatorial Control of Self-Assembling and Disassembling of Human Proteasome ?? Subunits. (2019)
  • 著者名/発表者名: Taichiro Sekiguchi,Tadashi Satoh,Eiji Kurimoto,Chihong Song,Toshiya Kozai,Hiroki Watanabe,Kentaro Ishii,Hirokazu Yagi,Saeko Yanaka,Susumu Uchiyama,Takayuki Uchihashi,Kazuyoshi Murata,Koichi Kato
  • 雑誌名: International Journal of Molecular Sciences 巻: 20 ページ: 2308
  • DOI: 10.3390/ijms20092308
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Construction of a Quadrangular Tetramer and a Cage-Like Hexamer from Three-Helix Bundle-Linked Fusion Proteins. (2019)
  • 著者名/発表者名: Takaaki Miyamoto,Yugo Hayashi,Keito Yoshida,Hiroki Watanabe,Takayuki Uchihashi,Kento Yonezawa,Nobutaka Shimizu,Hironari Kamikubo,Shun Hirota
  • 雑誌名: ACS Synthetic Biology 巻: 8 ページ: 1112?-?1120
  • DOI: 10.1021/acssynbio.9b00019
  • 査読あり
• [雑誌論文] The Fab portion of immunoglobulin G contributes to its binding to Fc?? receptor III. (2019)
  • 著者名/発表者名: Rina Yogo,Yuki Yamaguchi,Hiroki Watanabe,Hirokazu Yagi,Tadashi Satoh,Mahito Nakanishi,Masayoshi Onitsuka,Takeshi Omasa,Mari Shimada,Takahiro Maruno,Tetsuo Torisu,Shio Watanabe,Daisuke Higo,Takayuki Uchihashi,Saeko Yanaka,Susumu Uchiyama,Koichi Kato
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 9 ページ: 11957
  • DOI: 10.1038/s41598-019-48323-w
  • オープンアクセス
• [雑誌論文] Protein uptake into individual hydrogel microspheres visualized by high-speed atomic force microscopy. (2019)
  • 著者名/発表者名: Shusuke Matsui,Kensuke Hosho,Haruka Minato,Takayuki Uchihashi,Daisuke Suzuki
  • 雑誌名: Chemical communications (Cambridge, England) 巻: 55 ページ: 10064?-?10067
  • DOI: 10.1039/c9cc05116c
  • 査読あり
• [雑誌論文] On-Membrane Dynamic Interplay between Anti-GM1 IgG Antibodies and Complement Component C1q. (2019)
  • 著者名/発表者名: Saeko Yanaka,Rina Yogo,Hiroki Watanabe,Yuki Taniguchi,Tadashi Satoh,Naoko Komura,Hiromune Ando,Hirokazu Yagi,Nobuhiro Yuki,Takayuki Uchihashi,Koichi Kato
  • 雑誌名: International Journal of Molecular Sciences 巻: 21 ページ: 147
  • DOI: 10.3390/ijms21010147
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Structural basis of nucleosome assembly by the Abo1 AAA+?ATPase histone chaperone. (2019)
  • 著者名/発表者名: Carol Cho,Juwon Jang,Yujin Kang,Hiroki Watanabe,Takayuki Uchihashi,Seung Joong Kim,Koichi Kato,Ja Yil Lee,Ji-Joon Song
  • 雑誌名: Nature Communications 巻: 10 ページ: 5764
  • DOI: 10.1038/s41467-019-13743-9
  • オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Dynamics of Inter-Molecular Interactions Between Single A??42 Oligomeric and Aggregate Species by High-Speed Atomic Force Microscopy. (2019)
  • 著者名/発表者名: Lei Feng,Hiroki Watanabe,Paul Molino,Gordon G Wallace,Son L Phung,Takayuki Uchihashi,Michael J Higgins
  • 雑誌名: Journal of Molecular Biology 巻: 431 ページ: 2687 - 2699
  • DOI: 10.1016/j.jmb.2019.04.044
  • 国際共著
• [雑誌論文] An Assessment of the Ability of Submicron- and Micron-Size Silicone Oil Droplets in Dropped Prefillable Syringes to Invoke Early- and Late-Stage Immune Responses. (2019)
  • 著者名/発表者名: Elena Krayukhina,Masami Yokoyama,Kayoko Kakuhou Hayashihara,Takahiro Maruno,Masanori Noda,Hiroki Watanabe,Takayuki Uchihashi,Susumu Uchiyama
  • 雑誌名: Journal of pharmaceutical sciences 巻: 108 ページ: 2278?-?2287?
  • DOI: 10.1016/j.xphs.2019.02.002
• [学会発表] Imaging of Single-Molecule Dynamics using High-Speed Atomic Force Microscopy (2019)
  • 著者名/発表者名: Takayuki Uchihashi
  • 学会等名: The 2nd NIBB-Princeton Joint Symposium on Imaging and Quantitative Biology
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Real-Time Visualization of Biological Molecules at Work with High-Speed Atomic Force Microscopy (2019)
  • 著者名/発表者名: Takayuki Uchihashi
  • 学会等名: IEEE International Conference on Manipulation, Manufacturing and Measurement on the Nanoscale 2019
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Nanoscale Dynamic Imaging of Biological Molecules with High-Speed Atomic Force Microscopy (2019)
  • 著者名/発表者名: Takayuki Uchihashi
  • 学会等名: Frontier Bioorganization Forum 2019
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] High-Speed Atomic Force Microscopy for Direct Visualization from Single Protein to Cell Dynamics (2019)
  • 著者名/発表者名: Takayuki Uchihashi
  • 学会等名: EsCELLS visit talks
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Defect creation in microtubules and kinesin motility studied by HS-AFM (2019)
  • 著者名/発表者名: Christian Ganser, Kimitoshi Takeda, Ryota Iino, Koichi Kato and Takayuki Uchihashi
  • 学会等名: 27th International Colloquium on Scanning Probe Microscopy (ICSPM27)
  • 国際学会
• [学会発表] Real-Time Monitoring of Morphological Change of Metal Surface During Corrosion Process with High-Speed Atomic Force Microscopy (2019)
  • 著者名/発表者名: Takayuki Uchihashi, Mitsuhiro Okada, Miyuki Tanaka, Toshitaka Kubo, Tetsuo Shimizu
  • 学会等名: 27th International Colloquium on Scanning Probe Microscopy (ICSPM27)
  • 国際学会
• [学会発表] Kinesin transport on microtubules studied by HS-AFM (2019)
  • 著者名/発表者名: Christian Ganser and Takayuki Uchihashi
  • 学会等名: The 2nd NIBB-Princeton Joint Symposium on Imaging and Quantitative Biology
  • 国際学会
• [学会発表] Dynamics of photosystem II protein complexes as observed by high-speed atomic force microscopy (2019)
  • 著者名/発表者名: Takaya Tokano, Yuki Kato, Shogo Sugiyama, Takumi Noguchi, Takayuki Uchihashi
  • 学会等名: The 2nd NIBB-Princeton Joint Symposium on Imaging and Quantitative Biology
  • 国際学会
• [学会発表] 高速原子間力顕微鏡と生体・人工分子のダイナミクス計測 (2019)
  • 著者名/発表者名: 内橋貴之
  • 学会等名: 第23回コロイド・界面技術者フォーラム～コロイド領域のイメージング・評価技術～
  • 招待講演
• [学会発表] ダイナミンの動的分子イメージング：in vitro 再構成系×高速 AFM (2019)
  • 著者名/発表者名: 竹居孝二, 内橋貴之
  • 学会等名: ワークショップ「新しいコラボの在り方を探る～細胞生物学ｘ蛋白質科学」 第19回 日本蛋白質科学会年会, 第71回 日本細胞生物学会大会 合同年次大会
  • 招待講演
• [学会発表] 溶液中高速原子間力顕微鏡による生体・人工分子のダイナミクス解析 (2019)
  • 著者名/発表者名: 内橋貴之
  • 学会等名: シンポジウム「原子間力顕微鏡技術のパラダイムシフト～原子から細胞まで階層をまたぐ構造・機能解析～」 日本顕微鏡学会 第75回学術講演会
• [学会発表] 高速原子間力顕微鏡による生細胞イメージング (2019)
  • 著者名/発表者名: 内橋貴之
  • 学会等名: 日本学術振興会 ナノプローブテクノロジー第167委員会 第91回研究会
  • 招待講演
• [図書] 自己修復材料、 自己組織化、形状記憶材料の開発と応用事例 (2020)
  • 著者名/発表者名: 内橋貴之
  • 総ページ数: 446
  • 出版者: 技術情報協会
  • ISBN: 978-4-86104-781-7
• [備考] 名古屋大学D研ホームページ
  • URL: http://d.phys.nagoya-u.ac.jp/index.html