蛍光ダイヤモンドを用いた1生体分子NMR観察法の確立

2019 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 18H01838
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 原田 慶恵 大阪大学, 蛋白質研究所, 教授 (10202269)
• 研究期間 (年度): 2018-04-01 – 2021-03-31
• キーワード: 生物物理

研究実績の概要

ダイヤモンド内の窒素－格子空隙中心(NVC)の電子スピンの量子状態は、磁場によって変化する。この変化は、NVCが発する蛍光強度の変化として、光検出磁気共鳴(ODMR)分光法により測定することが可能である。このNVCを用いた局所磁場測定法を超高感度化することで、生体分子の核磁気共鳴 (Nuclear Magnetic Resonance, NMR)に挑戦する。今回目標とするのは10 nm立方に2,000個の^31P原子が含まれるDNAナノ構造が距離10 nmに生成する約30 nT核磁化信号強度の核スピンの検出である。磁場検出のより高いSNRを実現するには、ダイヤモンド内の完全に整列した高密度のNVセンターが必要である。ダイヤモンド内の完全に整列した高密度のNVセンターを実現することができれば、光ショットノイズの低減効果がある。そこで、（111）基板上にマイクロ波プラズマ化学蒸着（CVD）によってダイヤモンド膜を成長させた。空孔の増加による高い成長率で、N-V軸が7×10^17 cm-3と従来の密度の16倍となる最高のNV密度かつNVCの向きが完全に揃ったダイヤモンド基板が得られ、光学ショットノイズが従来の1/4に減少することを確認した。 さらに、異なる膜厚のCVD成長ダイヤモンドを用いた磁場イメージングでは、異なる厚さのNVを用いた磁場イメージングでは、ダイヤモンドの膜厚によって磁場分布パターンとSNRが異なることが明らかになった。したがって今後最大のSNRを得るには、NVCを含む層の厚さを最適化する必要がある。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

NVCのODMRを用いて常温低磁場で核スピンを検出するには、現状20,000個の原子核からの信号が必要である。本研究では、まず既存の技術を極め2,000個の原子核を検出する方法を確立する。本年度はダイヤモンド基板のさらなる改良を行った。（111）基板上にマイクロ波プラズマ化学蒸着（CVD）によってダイヤモンド膜を成長させた。 空孔の増加による高い成長率で、N-V軸が7×10^17 cm-3と従来の密度の16倍となる最高のNV密度かつNVCの向きが完全に揃ったダイヤモンド基板が得られ、光学ショットノイズが従来の1/4に減少することを確認した。 さらに、異なる膜厚のCVD成長ダイヤモンドを用いた磁場イメージングでは、異なる厚さのNVを用いた磁場イメージングでは、ダイヤモンドの膜厚によって磁場分布パターンとSNRが異なることが明らかになった。今後さらにNVCを含む層の厚さを最適化することでさらにSNRを改善することができる。以上から、今回目標とする10 nm立方に2,000個の^31P原子が含まれるDNAナノ構造が距離10 nmに生成する約30 nT核磁化信号強度の核スピンの検出が期待できる。

今後の研究の推進方策

現在、NVCのODMRを用いて常温低磁場で核スピンを検出するには、20,000個の原子核からの信号が必要である。本研究では、まず既存の技術を極め2,000個の原子核を検出する方法を確立する。そのために、どのような実験条件が高感度化の鍵であるかを明らかにする。核スピンは、検出可能距離が10 nm程度と短いため、多数の原子をNVCから半径10 nmという狭い領域に閉じ込める必要がある。そこで、原子数を自在に操作しやすく、化学修飾も容易なDNAやDNAおりがみ技術で作製したDNAナノ構造(10 nm立方に1,000塩基対をパッキング可能)を観察対象に用いる。DNAには多数のリン原子(100%が核スピン1/2の31P同位体)が含まれるが、通常のタンパク質には31Pが含まれないことを利用し、ダイヤモンド基板に固定したタンパク質にDNAが相互作用する様子を可視化する。NVCの磁気感度は最新のダイナミックデカップリング技術を適用すれば検出帯域が従来法より2桁狭まることが確認されており、この程度の濃度であれば、0.1 μT/√Hzが期待できる。一方、2,000個の31Pが距離10 nmに生成する核磁化信号強度は約0.03 μTであるため、NVCの直上にDNAナノ構造が配置された場合でもその検出には10 秒の積算が必要である。ODMR計測には十分に強い励起光をダイヤモンド基板に照射しつつ、長時間の積算中にDNAの活性を維持するためには、励起光をダイヤモンド基板内に閉じ込め、DNA自体の露光は最小となるよう、全反射照明での光励起を行う。

研究成果

• [雑誌論文] Tracking the 3D Rotational Dynamics in Nanoscopic Biological Systems. (2020)
  • 著者名/発表者名: Ryuji Igarashi, Takuma Sugi, Shingo Sotoma, Takuya Genjo, Yuta Kumiya, Erik Walinda, Hiroshi Ueno, Kazuhiro Ikeda, Hitoshi Sumiya, Hidehito Tochio, Yohsuke Yoshinari, Yoshie Harada, Masahiro Shirakawa
  • 雑誌名: Journal of the American Chemical Society 巻: 142 ページ: 7542-7554
  • DOI: 10.1021/jacs.0c01191
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] HCV IRES Captures an Actively Translating 80S Ribosome (2019)
  • 著者名/発表者名: Takeshi Yokoyama, Kodai Machida, Wakana Iwasaki, Tomoaki Shigeta, Madoka Nishimoto, Mari Takahashi, Ayako Sakamoto, Mayumi Yonemochi, Yoshie Harada, Hideki Shigematsu, Mikako Shirouzu, Hisashi Tadakuma, Hiroaki Imataka, Takuhiro Ito
  • 雑誌名: Molecular Cell 巻: 74 ページ: 1205-1214
  • DOI: https://doi.org/10.1016/j.molcel.2019.04.022
  • 査読あり
• [雑誌論文] Polydopamine Coating as a Scafold for Ring-Opening Chemistry To Functionalize Gold Nanoparticles (2019)
  • 著者名/発表者名: Shingo Sotoma, Yoshie Harada
  • 雑誌名: Langmuir 巻: 35 ページ: 8357-8362
  • DOI: https://doi.org/10.1021/acs.langmuir.9b00762
  • 査読あり
• [雑誌論文] Formation of perfectly aligned high-density NV centers in (111) CVD-grown diamonds for magnetic field imaging of magnetic particles (2019)
  • 著者名/発表者名: Hayato Ozawa, Yuji Hatano, Takayuki Iwasaki, Yoshie Harada, Mutsuko Hatano
  • 雑誌名: Japanese Journal of Applied Physics 巻: 58 ページ: SIIB26
  • DOI: https://doi.org/10.7567/1347-4065/ab203c
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Multifunctional temozolomide-loaded lipid superparamagnetic nanovectors: Dual targeting and disintegration of glioblastoma spheroids by synergic chemotherapy and hyperthermia treatment (2019)
  • 著者名/発表者名: Attilio Marino, Alice Camponovo, Andrea degl'Innocenti, Martina Bartolucci, Christos Tapeinos, Chiara Martinelli, Daniele de Pasquale, Francesca Santoro, Valentina Mollo, Satoshi Arai, Madoka Suzuki, Yoshie Harada, Andrea Petretto, Gianni Ciofani
  • 雑誌名: Nanoscale 巻: 11 ページ: 21227-21248
  • DOI: 10.1039/c9nr07976a
  • 査読あり / 国際共著
• [学会発表] Dual-functionalized fluorescent nanodiamond as nanoheaters and nanothermometers in cells (2020)
  • 著者名/発表者名: Chongxia Zhong, Shingo Sotoma, Taras Plakhotnik, James Chen Yong Kah, Yoshie Harada, Madoka Suzuki
  • 学会等名: 2020 Annual Meeting - Biophysical Society
  • 国際学会
• [学会発表] １分子イメージング顕微鏡によるタンパク質の機能解析 (2019)
  • 著者名/発表者名: 原田慶恵
  • 学会等名: 京都産業大学生命科学部バイオフォーラム
  • 招待講演
• [学会発表] NVセンターの生命科学計測への応用 (2019)
  • 著者名/発表者名: 原田慶恵、外間進悟、波多野雄治、波多野睦子
  • 学会等名: 量子生命科学研究会第1回大会
• [学会発表] Fluorescent nanodiamond as a robust temperature sensor inside a single cell (2019)
  • 著者名/発表者名: Yoshie Harada, Takeharu Sekiguchi, Shingo Sotoma
  • 学会等名: The third International Workshop on Symbiosis of Biology and Nanodevices
  • 国際学会
• [学会発表] Development of a New Fluorescence Imaging Technique Using Nitrogen Vacancy Centers in Diamond (2019)
  • 著者名/発表者名: Yoshie Harada
  • 学会等名: 17th Chinese Biophysics Congress
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Fluorescent nanodiamonds as a robust temperature sensor inside a single cell (2019)
  • 著者名/発表者名: Shingo Sotoma, Yoshie Harada
  • 学会等名: E-MRS 2019 Fall Meeting
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Fluorescent nanodiamonds for bioimaging applications (2019)
  • 著者名/発表者名: Shingo Sotoma, Feng-Jen Hsieh, Huan-Cheng Chang, and Yoshie Harada
  • 学会等名: E-MRS 2019 Fall Meeting
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] 磁性粒子とダイヤモンド基板中のNVセンタを用いた細胞計測 (2019)
  • 著者名/発表者名: 波多野 雄治，多田隈 尚史，岩崎 孝之，波多野 睦子，原田 慶恵
  • 学会等名: 第80回応用物理学会秋季学術講演会
• [学会発表] Application of individual fluorescent nanodiamond as nanothermometer and nanoheater (2019)
  • 著者名/発表者名: Chongxia Zhong, Shingo Sotoma, Yoshie Harada, Madoka Suzuki
  • 学会等名: 第57回日本生物物理学会年会
• [備考] 蛋白質ナノ科学研究室
  • URL: http://www.protein.osaka-u.ac.jp/laboratories/nanobiology
• [産業財産権] 磁気画像計測装置 (2019)
  • 発明者名: 原田慶恵、波多野雄治、多田隈尚史、波多野睦子、岩崎孝之
  • 権利者名: 原田慶恵、波多野雄治、多田隈尚史、波多野睦子、岩崎孝之
  • 産業財産権種類: 特許
  • 産業財産権番号: 特願2019-97873