| 研究課題/領域番号 |
18H01839
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
廣島 通夫 国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, 上級研究員 (20392087)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | １分子イメージング・ナノ計測 / １分子生体情報学 |
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| 研究実績の概要 |
1分子イメージングにより、上皮成長因子受容体（EGFR）などの細胞膜受容体が活性化すると、その動態に顕著な変化が生ずることが見出されている。この知見を、薬剤や細胞のスクリーニングに応用すれば画期的な創薬手法となる可能性[3]があるが、その基盤となる分子動態が変化するメカニズムが分かっておらず、汎用的な手法として確立することを困難にしている。本研究は、このメカニズムを分子構造や細胞膜環境と関連付けて解明し、細胞内1分子スクリーニングの基盤となる手法の実効性を裏付ける。
そこで、活性化により構造変化して動態に影響を及ぼすと考えられる、1) 細胞外ドメイン、2) 二量体形成アーム、3) C末リン酸化領域、4) 細胞質側ドメイン、5) 細胞膜近傍領域 の各部位について、欠損あるいは点変異を導入したGFPとの融合タンパク質の作成を計画した。2019年度は、前年度に作成が終了した2), 4)を欠損した変異体の発現株について、野生型と併せ、自動化システムによる1分子イメージングを行った。解析の結果、現在までに分子構造と動態の明確な相関関係を示す結果が得られている。また前年度に引き続き、細胞膜サブドメインの構成脂質を減少させた計測を行い、受容体の動態と二量体／多量体の形成、および下流のシグナル伝達との関係の対応関係を明らかにした。こうして、受容体分子の活性化と動態を結ぶメカニズムについて多くの知見が得られてきている。さらに本研究計画の次の発展を見越して、EGFRの癌変異体や抗癌剤を用いた1分子イメージングを開始し、上記の知見に基づいて説明可能な結果が得られている。
一方、動態変化に関連する分子内構造の変化を蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）により計測する計画は、想定していた蛍光ラベルの効率がかなり低く計測に不向きであるとの情報が得られたため、ラベル方法を変更して進めることとした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究では、細胞膜受容体分子の活性化と動態を結ぶメカニズムを解明するため、EGFRの活性化に伴って変化する分子動態について 1) 分子構造、2) 細胞膜環境 の寄与に着眼して解析する。1) については、活性化と関連する部位を変化させた5種類の変異体それぞれを細胞で発現させ1分子計測を行う。2種類の変異体については、計画以上に進展し安定発現株による効率の良い計測が可能となり、野生型と併せて新しい知見を得ることができた。残りの変異体については、細胞株作成の困難と直面しながらも作成を進めている。なお、 FRETにより動態変化と関連した分子内構造の計測については、蛍光ラベルの方法を変更して修飾効率を上げることが必須と判明したため、実験計画を2020年度へと繰り越した。
2) については、細胞膜サブドメインを構成するコレステロールまたはスフィンゴミエリンを減少させると、分子動態の変化と対応する二量体形成がそれぞれ異なることが明らかになった。また、受容体のリン酸化にこれらの違いが反映されていた。前年度の結果からさらに進展し、細胞膜環境と受容体の分子動態、および活性化の三者間の対応関係が明確となった。一方、双方とも多量体の形成は減少し、下流シグナルのリン酸化も大きく減っていた。これは、EGFRの多量体が細胞膜サブドメイン上でシグナリングのハブを形成していることを示している。この結果を応用すれば、細胞膜環境を操作して受容体の動態を変え、細胞応答を変化させることができるかもしれない。
成果（論文）発表に関しては、本研究内容と密接に関連した総説1報（査読有）が、研究代表を筆頭著者として出版された。
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| 今後の研究の推進方策 |
2019年度に引き続き、EGFRを構成する各ドメインを欠損させた変異体を作成し、活性化に伴う動態変化において分子構造が関与するメカニズムを解明する。GFPとの融合タンパク質として、1) 細胞外全ドメイン、2) C末リン酸化領域、3) 細胞膜近傍領域 の変異体を構築、安定発現株を取得していく。得られた細胞株について1分子解析を行い、各変異が及ぼす動態変化を定量的に比較する。また、ウェスタンブロッティングを用いたリン酸化定量により、EGFRおよび下流シグナル分子の活性化と、EGFRの分子構造および動態との相関を調べる。
また、細胞膜ドメインに関与する因子がEGFRの動態に及ぼす影響を明らかにするため、蛍光2波長1分子イメージングを用いて、EGFRに加え、アダプター蛋白質、細胞骨格や脂質分子についてその分布などを観測する。得られた結果から細胞膜周辺環境と、分子動態および活性化との相関を調べる。
異なる蛍光色素でラベルしたEGFと細胞膜脂質の間で生じるFRETを1分子計測する計画については、2019年度に従前のラベル方法の問題点が示されたため、修飾効率を上げる手法の確立を目指す。適切なラベル条件を用いることで、EGFRの細胞外ドメインと細胞膜間の距離変化の追跡を可能とし、構造のダイナミクスや、変異により生じた変化が分子動態に与える影響を解析する。
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