研究課題
本研究では、走査型電気化学顕微鏡‐走査型イオンコンダクタンス顕微鏡システムにより細胞とバイオマテリアルを複合した生体医療材料を評価する。探針電極が100 nm以下のスケールに突入することによって顕在化してきた探針‐基板間の相互作用、探針および試料表面の表面電荷について詳細に検討する。特に、異なる細胞種やタンパク質、細胞外マトリックスが混在する複雑な組織モデル系試料を対象に、nmスケールの形状と機能情報を集約し、生体材料の設計・選定、細胞‐細胞間相互作用や微小環境の制御を通じて、新しい組織モデルの構築に貢献することを目標とする。探針電流値に対する探針内壁および細胞試料表面の電荷密度や探針近傍のイオン強度の影響を精査し、顕微鏡画像の解像度・品質向上に反映させることで、生体医療材料を形状と機能の両面から評価する。走査型プローブ顕微鏡SPMにより組織モデルの高解像度画像を取得し、標的細胞から極微量サンプルを回収して網羅的遺伝子発現解析を可能とする装置システムを開発するために、アプローチカーブの解析、形状画像と電気化学画像の干渉、プローブの化学修飾、表面電荷マッピング、培養細胞・細胞塊の評価、組織モデル系における生体材料-生体医療材料複合体の多項目分析、などの課題について重点的に取り組む。2019年度は、アプローチカーブ解析、培養細胞・細胞塊の評価、組織モデル系における細胞‐生体医療材料複合体の多項目分析に取り組んだ。バイオマテリアルと細胞集団が共存する「生体医療材料複合体」に関し、生体内微小管環境を再現する具体的な系を構築しハイドロゲル、エラストマー、多孔質膜などを活用することが可能となった。
2: おおむね順調に進展している
二年目を終了した時点で、申請時の研究計画のなかに含まれるすべての項目について着手することができた。予想通りの結果が得られなかった項目に関しても改善すべき点を整理した上で、最終年度にむけ研究成果を逐一発表しながら、新たな研究展開も期待できる段階にある。総じて順調に進展していると判断した。１．アプローチカーブ解析：イオンコンダクタンスを信号として、生体試料実サンプルを対象に、アプローチカーブの取得、フィードバック機構によりプローブ-試料間の距離制御について検討した。サンプル近傍の酸素濃度に関し、詳細な濃度プロファイル解析を検討した。具体的には、ヒト間葉系幹細胞の骨分化モデル、三次元組織モデル、がん細胞株細胞凝集体、血管内皮細胞-繊維芽細胞共培養系細胞凝集体、コラーゲンゲル包埋血管内皮細胞由来の血管モデル、細胞外マトリックスと単一細胞の境界部などに対し、プローブのアプローチに成功した。２．培養細胞、細胞塊の評価：培養細胞、細胞凝集体、共培養系細胞凝集体、臓器モデルを指向したデバイス上での微小流路三次元培養系などを対象に、上記プローブ顕微鏡観察に基づく形状・呼吸・代謝の評価に加えて、アルカリホスファターゼ活性、骨分化マーカー、タンパク質、遺伝子、増殖活性の機能評価や、組織標本的観察の検討を実施した。３．組織モデル系における細胞‐生体医療材料複合体の多項目分析：ナノマテリアルやハイドロゲル、エラストマー、多孔質膜など機能化学物質が共存する環境において、材料・基板自体の物性・機能評価の実施と細胞の形状、機能の評価の実施をおこなうことができた。
１．アプローチカーブ解析：最終年度はこれまでの知見を活かし、組織モデルや共培養系細胞塊、ヒト間葉系幹細胞(hMSC)の分化過程など、実サンプルに対して試料侵襲性の低い探針アプローチ方法を検討する。昨年度に引き続き、計測システム自体の高感度・高時間分解・高空間分解能化を検討する。２．培養細胞、細胞塊の評価：昨年度に引き続き、組織モデル試料の機能評価を検討するために、ガラス電極、SECM探針、電気化学シリンジを試料に近接させ、形状情報や酸素濃度、酵素活性、遺伝子発現等機能情報を取得する。特に酸素濃度計測に関し、測定セル・細胞塊の形状・配置を考慮に入れた濃度勾配解析により、正確に酸素消費量を計算する。組織モデル試料として胚性幹細胞(ESC)、ヒト間葉系幹細胞(hMSC)の分化過程、がん細胞塊、血管内皮細胞、線維芽細胞およびこれらの細胞間の相互作用に着目して機能評価を検討する。2次元/3次元培養系において、細胞の分化過程や形質変換過程における形状および機能変化を走査型イオンコンダクタンス顕微鏡SICMにより検討する。上皮系培養細胞を対象に、１細胞レベルで細胞膜と接着基板間の相互作用を評価する。３．組織モデル系における細胞‐生体医療材料複合体の多項目分析：昨年度に引き続き、細胞外マトリクスやハイドロゲル、エラストマー、多孔質膜など機能化学物質が共存する環境における細胞の形状や異なる機能を複数取得する多項目分析により、詳細な情報を得る。最終年度の総括として積極的に成果の発表をおこなうと共に、新しい三次元培養系の設計、in vitroにおける生体内相互作用の再現・再構築に資する指針を提示する。
すべて 2020 2019 その他
すべて 雑誌論文 (12件) (うち国際共著 2件、 査読あり 12件、 オープンアクセス 1件) 学会発表 (18件) (うち国際学会 6件、 招待講演 1件) 図書 (1件) 備考 (1件)
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