研究課題
本研究で対象とする、高等真核生物を特徴づけるRNA転写後修飾について、(1)新規に特定したキューオシン(Q)糖付加酵素(QTMANと命名)の機能探索を行った。具体的には、熱不安定変異を導入したホタルルシフェラーゼ(Fluc)にGFPを融合させたタンパク質をレポーターに発現させ、タンパク質凝集体を形成した細胞数の違いをWTとQTMANノックアウト(KO)細胞で比較した。KO細胞における凝集体数の増加が観察されたことから、糖付加Qの欠損によるデコーディング速度が乱され、新規合成タンパク質の折り畳み不良が凝集体形成を誘発したと推測された。また、QTMANの基質糖ヌクレオチドとの杵ティクス解析を行い、uMオーダーのKmを得た。糖ヌクレオチドの細胞内濃度(文献値)がKmと同オーダーであったことから、糖ヌクレオチドの細胞内濃度変動により糖付加Q形成率が制御される可能性が示唆された。(2)タウリン修飾の、タウリン欠乏環境への応答によるグリシン型修飾への置換現象を評価する解析系を確立した。タウリン欠乏条件を下地に培地中グリシン濃度の増加によりグリシン型構造へ置換が亢進された。またin vitro修飾再構成系を高効率化するための条件をさらに更新した。(3) f5C生合成反応における中間体修飾構造の翻訳開始への影響の評価につながる、ミトコンドリアタンパク合成のリボソームプロファイリングを試みるため、WTとf5C修飾遺伝子KO細胞からのミトコンドリア由来フットプリント調製を可能とする条件検討を進め、サンプルをプールしている。
2: おおむね順調に進展している
QTMANのKO細胞を用いた凝集体アッセイにより、培養細胞レベルでの細胞の性質の違いが初めて観察された。糖付加Q欠損におけるデコーディング異常を示す結果が共同研究により得られており、その観察から導かれる洞察とも一致する結果と言える。他の修飾についても、培地成分の濃度変化で模した、代謝変動による修飾構造状態の違いを生む経路を見出すなど、次の解析に向けた検討が順当に進行しているといえる。
糖付加Qについて、培養細胞レベルでの性質の違いが見いだされたことから、動物個体における意義を解明するための共同研究をさらに進める。現在進行中の連携によりKO動物における糖付加Qの欠失などについて基礎的なデータを補強していく。またQTMAN等の新規酵素の構造解析や、デコーディングにおける糖付加Qの役割についてCryoEMによる構造解析など、修飾に関する詳細な知見を得る共同研究の展開を強化する。またそれ以外に進行中である対象の修飾についても引き続きの解析を進める。
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