研究課題
本研究では、標的RNAと結合することによりその構造変化を誘導することのできる小分子リガンド「RNA分子糊」を用いて、遺伝子発現調節RNAスイッチを構築する。RNA分子糊によるリボザイム（RNA鎖切断を触媒するRNA酵素）の高次構造制御と活性制御を介して、遺伝子発現の精密制御、すなわち、１）抑制（OFFスイッチ）、２）促進（ONスイッチ）、３）双方向切り換え（光刺激による可逆的スイッチ）、を実現し、RNA結合リガンドを基盤とした合成生物学的システムを確立する。本年度は、項目１）について、当初計画から用いているハンマーヘッド型リボザイムに加え、異種リボザイムであるツイスターリボザイムについてRNA分子糊応答性付与に向けた改変を実施した。項目２)について、RNA分子糊が作用することで、リボザイムの触媒活性を抑制させる改変リボザイムの設計、構築を行った。RNA分子糊添加に依存して、非細胞系でリボザイム活性が大きく低下することを確認した。項目３）については、前年度までに開発を進めてきた光応答性RNA結合リガンドをもちいて、非細胞系でのリボザイム活性の双方向制御を実現した。RNAへの親和性の小さいE体のリガンドと比して、光照射しZ体リガンドは、標的となるリボザイムに結合し、活性構造をもつフォールディングを誘起する、光応答性のリボザイム活性化能を示した。項目２）、３）について、同システムを遺伝子発現調節RNAスイッチとして用いたヒト培養細胞系での機能評価を進めている。
2: おおむね順調に進展している
本年度は、抑制型、促進型、異種リボザイムなどの、拡張機能を有するRNA結合分子応答性リボザイムの創成を実施した。また、双方向切り換え実現に向けた、光応答性システムの構築を行った。光照射によるリボザイムの双方向的な制御が可能であることを実証し、概ね当初の計画通りに進行していると判断している。これまで、ハンマーヘッドリボザイムを標的としてRNA結合分子でリボザイムの高次構造を変化させ、リボザイム触媒活性を制御（活性化）することが本研究の基盤となっている。他の機能性RNAへの展開は、本システムの応用可能性を図るうえで欠かせない。高活性、小型で全く異なる高次構造を有する、ツイスターリボザイムのリガンド応答化を試みた。種々改変したツイスターリボザイムを合成し、リガンド添加により活性化する変異体の構築に成功したが、活性変化量は従来のハンマーヘッドリボザイムに及ばず、更なる改良化を進めている。また、リボザイム活性を抑制するシステムとして、リボザイム活性構造からリガンド結合により、不活性構造に変換されるハンマーヘッドリボザイムの設計、創成を行った。リガンド添加により、リボザイムが折りたたみ構造を取らないこと、触媒活性が大きく低下することを確認した。双方向切り換えを指向した、光応答性RNA結合リガンドの開発を引き続き進め、光異性化特性の定量、光異性化能の最適化を行った。光応答性リガンドは、光照射の前後に依存して、リボザイムへの結合能が大きく変化し、360 nmの照射で生じるZ体で、結合活性が増大する。リガンドはRNA分子糊として機能し、リガンド結合によりリボザイムが折りたたまれ、触媒活性が増大することを明らかにした。同システムを遺伝子発現調節RNAスイッチとして用いたヒト培養細胞系での機能評価を進めており、発現抑制効果を確認している。
本年度までに開発を進めてきた、抑制（OFFスイッチ）、促進（ONスイッチ）、双方向切り換え（光刺激による可逆的スイッチ）、それぞれについて、RNA結合分子により期待した応答を示すことを非細胞系で確認した。細胞内での作動も確立している抑制型スイッチでの知見を基盤として、各RNAスイッチについても細胞系での遺伝子発現スイッチ実現を目指し更に展開を推し進める。
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