2018 年度実績報告書

新たなゲノム機能調節機構の解明につながる好熱バチルスの制御因子Crhの解析

研究課題

研究課題/領域番号	18H02128
研究機関	神戸大学
研究代表者	吉田健一神戸大学, 科学技術イノベーション研究科, 教授 (20230732)
研究分担者	石川周神戸大学, 科学技術イノベーション研究科, 准教授 (30359872)
研究期間 (年度)	2018-04-01 – 2022-03-31
キーワード	Geobacillus kaustophilus / Crh / イノシトール
研究実績の概要	GK親株にhprK G268R変異のみを導入しiol遺伝子群が発現しなくなる原因がこの変異に他ならないことを確証するために、まず元来存在するhpr K遺伝子を削除する必要がある。昨年度はこの遺伝子削除を進めたが、hprKの欠失により生育が低下するために、この変異株の作成に予定を上回る時間と労力を要した。また、hprK削除株においては、驚いたことに誘導物質の有無にかかわらずiol遺伝子群が完全に構成的に発現していることが判明した。この結果は、Crhのリン酸化がiol遺伝子群の抑制において必須であることを示唆する新たな発見でもある。さらに、このhprK削除株に野生型のhprKあるいはhprK G268R変異を導入し、機能の相補を観察しようと試みたが、プロモーターの選定が不適切であったためかこれを確認することはできなかった。そこで、来年度はまずこの相補実験の完成を第1目標とし、この達成によってもたらされる人工的なHPrK G268R変異株においてはiol遺伝子群が発現しなくなると予想されるので、この株においてCrhを破壊してiol遺伝子群の発現の回復を確認する。これによって、従来のカタボライト抑制ならびにCrhと相互作用する因子とCrhの第3機能との関連を理解できると予想している。一方、上記HPrK G268R変異+Crh破壊株においてCrh-Hisを発現させると、再びiol遺伝子群が抑制されるはずである。細胞内のCrh-Hisを精製して、リン酸化されP-Ser-Crh-Hisとなっていることを確認するとともに、細胞内クロスリンクによりP-Ser-Crh-Hisと相互作用する他のタンパク質因子を質量分析計によって同定して、Crhの第3制御機能に関わる「未知のパートナー」の特定に着手する。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 2: おおむね順調に進展している理由 GKにおいてはhprKの欠失により生育が低下するために、この変異株の作成に予定を上回る時間と労力を要した。しかし、結果的に得られたhprK削除株においては、驚いたことに誘導物質の有無にかかわらずiol遺伝子群が完全に構成的に発現していることが判明した。この結果は、Crhのリン酸化がiol遺伝子群の抑制において必須であることを示唆する新たな発見でもある。さらに、このhprK削除株に野生型のhprKあるいはhprK G268R変異を導入し、機能の相補を観察しようと試みたが、プロモーターの選定が不適切であったためかこれを確認することはできなかった。そこで、来年度はまずこの相補実験の完成を第1目標とし、この達成によってもたらされる人工的なHPrK G268R変異株においてはiol遺伝子群が発現しなくなると予想されるので、この株においてCrhを破壊してiol遺伝子群の発現の回復を確認する。これによって、従来のカタボライト抑制ならびにCrhと相互作用する因子とCrhの第3機能との関連を理解できると予想している。
今後の研究の推進方策	hprK削除株においては、驚いたことに誘導物質の有無にかかわらずiol遺伝子群が完全に構成的に発現していることが判明した。この結果は、Crhのリン酸化がiol遺伝子群の抑制において必須であることを示唆する新たな発見でもある。さらに、このhp rK削除株に野生型のhprKあるいはhprK G268R変異を導入し、機能の相補を観察しようと試みたが、プロモーターの選定が不適切であったためかこれを確認することはできなかった。そこで、まずこの相補実験の完成を第1目標とする。次いで、この第1目標の達成によってもたらされる人工的なHPrK G268R変異株においてはiol遺伝子群が発現しなくなると予想されるので、この株においてCrhを破壊してiol遺伝子群の発現の回復を確認する。加えて、HPr、CcpAならびにMgsAについても同様に破壊し、影響を検討する。これによって、従来のカタボライト抑制ならびにCrhと相互作用する因子とCrhの第3機能との関連を理解できると予想している。一方、上記HPrK G268R変異+Crh破壊株においてCrh-Hisを発現させると、再びiol遺伝子群が抑制されるはずである。細胞内のCrh-Hisを精製して、リン酸化されP-Ser-Crh-Hisとなっていることを確認するとともに、細胞内クロスリンクによりP-Ser-Crh-Hisと相互作用する他のタンパク質因子を質量分析計によって同定する。これによって、Crhの第3制御機能に関わる「未知のパートナー」の特定に着手する。別の研究テーマの進展により、IolQと名付けた制御因子がパートナー候補として浮上しているので、これを仮想パートナーと見なした実験も並行して進める。