| 研究課題/領域番号 |
18H02132
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| 研究機関 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 |
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研究代表者 |
松沢 智彦 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 主任研究員 (10711971)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 酵素 / 麹菌 / 糖質 / 転写制御 / キシログルカン |
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| 研究実績の概要 |
麹菌Aspergillus oryzaeがオリゴ糖存在下において発現を誘導する推定糖質分解酵素の機能解析を進め、新たに植物由来多糖類（キシログルカン）の分解に重要な酵素（α-キシロシダーゼ）を見いだすことができた。本酵素はこれまでの研究において同定したイソプリメベロース（グルコースとキシロースから成る二糖）生成酵素によって生成されたイソプリメベロースを分解する酵素であり、イソプリメベロース以外にもキシログルカンオリゴ糖のキシロース側鎖にも作用することが明らかになった。本酵素以外にも、多糖類をオリゴ糖化する複数の糖質加水分解酵素を同定することができた。また、昨年度までに見出したオリゴ糖依存的に発現が誘導される酵素をコードする遺伝子を破壊した麹菌の作製を行った。
昨年度までに単離したユニークな酵素について結晶構造解析を進め、その立体構造情報を基に、複数の変異酵素の取得およびその酵素学的諸性質の解析によって酵素の基質認識メカニズムなどの解析を進めた。
昨年度までに行ったトランスクリプトーム解析の結果を参考に、新たな培養条件での遺伝子発現解析（リアルタイムPCR解析など）を進めた。また、上記酵素をコードする遺伝子の転写制御機構を明らかにするために、Yeast One Hybrid法による当該遺伝子の推定プロモーター領域に結合する転写因子を探索するための基盤構築を進めた。具体的には、レポーターアッセイに使用するプロモーター領域の検討や複数の推定転写因子のクローニングなどを進めた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
これまでに取得したトランスクリプトームデータを補完するために、様々な培養条件において麹菌を培養し、リアルタイムPCR解析などによって当初の予定通り遺伝子の発現解析を進めることができた。
オリゴ糖に応答するための転写制御メカニズムを解明するために、オリゴ糖存在下において発現が誘導される遺伝子のプロモーター解析やレポーターアッセイなどを進めるための基盤構築を進めることができた。しかし、本年度の研究を進める中で、プロモーターやそこに結合する転写因子の解析では、使用・解析するプロモーター領域の選定などを当初予測していたよりもより丁寧かつ慎重に進めなければならない等の様々な課題が明らかになってきた。
複数の新規糖質分解酵素の同定し、解析を進めることができた。また、新たに同定した酵素とこれまでに同定した酵素の協調的作用など、植物由来多糖類の分解における酵素-酵素間の役割分担なども考察を進めることができた。しかし、トランスクリプトーム解析などから絞り込んだ（着目した）酵素のうち、一部の酵素に関しては異種宿主発現および精製に成功しておらず、今後、発現系や精製系の検討が必要である。
また、同定した糖質分解酵素をコードする遺伝子の破壊などを順調に進めることができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまでに同定したオリゴ糖分解酵素をコードする遺伝子のプロモーター領域を利用し、オリゴ糖を介した環境認識に重要な転写制御因子やDNA領域などの特定を進める。
糖質分解酵素欠損株のオリゴ糖への応答性や多糖類・オリゴ糖の資化性などを調べ、同定した糖質分解酵素の重要性を検証する。
また、新規酵素の探索を進め、オリゴ糖利用の全体像を明らかにする。
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