| 研究課題/領域番号 |
18H02134
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
人見 清隆 名古屋大学, 創薬科学研究科, 教授 (00202276)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | トランスグルタミナーゼ / タンパク質架橋化酵素 / 上皮組織 / バリア機能 |
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| 研究実績の概要 |
タンパク質を架橋接着する酵素ファミリー「トランスグルタミナーゼ（以下TGase）」は様々な組織で多彩な生理作用を担う。本課題では上皮組織に着目し、その適切な硬度保持を始めとする機能に、本酵素がどう寄与しているのかを研究している。①上皮組織から高度化に関わる新たな基質を探索し、得られた基質の架橋部位を明らかにする方法を構築すること、②得られた基質とその産物の機能解析を進めるとともに、③モデル生物のメダカでのタンパク質架橋化酵素の変異体の解析を行った。
基質探索については、腎・肝・表皮に加えて肺についても、異常な硬度化が生じる線維症モデルを構築して探索を進めた。当該年度は従来のビオチン標識基質を活用しての精製を行ったが、同定手法としての質量分析の精度を改良し、肺の正常時・線維症時の双方で基質を同定した。分化した表皮細胞で新たに得たgasderminは新規な基質で、分化に伴いプロセスされ、かつ高い反応を示した。
肝線維症においてすでに、サイトケラチンを基質として同定している。過剰な硬度化は細胞死を引き起こすため、肝由来の細胞株を対象に、同分子とTGaseの発現、疾患状態を引き起こす薬剤を添加した際のTGaseの性状を調べた。さらにsiRNAノックダウン手法によりTGase変動を減じた際の細胞死を調べた。
肺由来の上皮系細胞株において、TGase遺伝子を除去した細胞株を樹立した。この樹立については、解析に足るだけの細胞株を得ることが遅れ、性状解析については翌年度に延長した。得た細胞での遺伝子は完全に欠損され、今後比較対照として有用であり、比較して基質探索、産物の挙動を調べることができる。
メダカについては、TGase相当遺伝子を欠損した個体が、行動異常の表現型を見出していたため、上皮組織に加えて脳神経組織における詳細な発現分布を解析した。
以上の成果を学術論文および学会にて発表した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
すでに基質同定方法については確立しており、新たに肺上皮組織および立体培養系で分化させた表皮細胞から基質分子候補を精製同定した。同定には従来よりも感度の良い質量分析方法を取り入れ、有力な候補をより検索しやすくした。その結果、線維症状態の肺組織や分化(硬化)に近づいた表皮細胞から、特異的ないくつかの分子基質を同定できた。肺ではコラーゲンをはじめとする基質の発現動態も併せて解析するとともに、表皮細胞からは新たな基質としてgasderminを同定した。
一方で、これまで硬化した線維化状態の肝組織で基質として同定していたサイトケラチンについても、肝由来の培養細胞系を用いて解析を進めた。ここでは細胞死との関連も含め、基質と反応産物分子が細胞の硬度化や機能変化にどのように関わるかを明らかにした。
並行してヒト肺由来の上皮細胞株の代表的な細胞株A549を対象にして、ゲノム編集技術によりTGase（TG2）遺伝子の恒常的な欠損株を確立し、タンパク質発現が完全に欠損していることも確認した。この細胞は生育・接着・進展には特に変化はなく、基質の探索等に野生株と比較するには適切であると判断した。
モデル生物としてのメダカのTGaseについては、皮膚型（TG1）および組織型(TG2)に相同な遺伝子を欠損した個体を得ているが、上皮組織での発現やバリア機能の状態、生育状況を調べると同時に、上皮組織と共に加えて脳神経組織における詳細な発現分布を解析した。
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| 今後の研究の推進方策 |
上皮組織の硬度化にタンパク質架橋酵素反応がどのように関わるかという課題を多面的にアプローチし、最終年度として以下のように進めたい。候補基質群の組換え体としての再現と反応検討、それぞれが硬度化にどのように貢献するかのメカニズムを提唱したい。
各種の臓器からの上皮組織由来の基質分子を多種同定し、いくつかについては組換えタンパク質としても再現できている。これらを用いて、今後はまず基質部位を同定する。このことにより、産物の組換え体再現について競合阻害（剤）としても活用できるため、質量分析を駆使することで可能と考えている。また基質を細胞で発現させた場合、過剰な場合での上皮細胞株の挙動がどのようになるかを解析する。さらには架橋産物分子を再現し、これが細胞に与える影響、効果についても検討したい。
また、TGaseを欠損およびノックダウンできる上皮細胞系を確立すると同時に、さらなる発展を考えて遺伝子欠損マウスの活用もめざしている（皮膚型TG1）。すでに準備状況として、誘導的に本遺伝子を欠損するマウスを成育しており、組織特異的および成体(時期)特異的な上皮組織の硬度化やバリア機能を解析する。
血液凝固トランスグルタミナーゼを制御するトロンビンは、凝固に向けてタンパク質架橋化酵素を活性化すると同時に、防御機能にも寄与するとされている。メダカをモデルにしてトロンビンの類似遺伝子を対象にして解析したところ、皮膚やエラなど上皮組織にも存在することを見出した。哺乳類トロンビンの分解物が抗菌活性を示す報告もあり、組織の硬度化やバリア機能に貢献するかどうか、別目的で作製していたトロンビンの遺伝子欠損個体も用いて、タンパク質架橋化と並行してその上皮組織での機能解析も進めたい。
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