| 研究課題/領域番号 |
18H02147
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
三芳 秀人 京都大学, 農学研究科, 教授 (20190829)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | Na+-輸送性NADH-キノン酸化還元酵素 / コレラ菌 / 薬剤耐性 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、Na+-NQR を化学修飾するという有機化学的手法を基盤にして、Na+-NQR のコンフォメーション変化を直接的に観察する２つの実験系を確立し、「Na+-NQRの動きと抵抗性」の関係を精査することによって、本酵素特有の抵抗性獲得メカニズムの解明を目指す。本年度は、代表的な阻害剤であるコロルミシンとオーラシンを鋳型として合成したプローブ分子を用いるトシル化学法によって、野生型および抵抗性酵素のNqrBサブユニットの求核性アミノ酸残基に対してアジド基を導入することを実施した。導入したアジド基は、その後の化学修飾の足場として利用する。
具体的には、コロルミシンとオーラシンの側鎖部分に、アジド基を有するトシル基を導入する分子プローブを合成した。分子プローブは本酵素に対して高い結合親和性（高い阻害活性）を持つことを確認した。この結果を受け、得られた分子プローブを単離酵素（Na+-NQR）に作用させてトシル化学法を実施した結果、トシル化学反応の進行に長時間を要することから（少なくとも8時間以上）、単離酵素が凝集してしまうことがわかった。凝集してしまった酵素は、その後の実験には用いることができない。そこで、より短時間でトシル化学反応が完結できるトシル性の反応性基に置き換える必要が出てきた。これを踏まえ、トシル部の構造改変を実施ている段階である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
アジド基を有する通常のトシル基では、精製したNa+-NQRに対してプローブ分子の結合親和性が高くても、NqrBサブユニットの求核性アミノ酸残基との反応性が遅いために、酵素が凝集してしまうという全く予想していなかった事態になった。そのため、より短時間でトシル化学反応が完結すと期待できるトシル基（N-acyl-N-alkyl sulfonamide）に変更して合成するという計画変更を行った。
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| 今後の研究の推進方策 |
研究目標を達成するためにNa+-NQRの１分子計測に持ち込むため、野生型および抵抗性酵素のNqrBサブユニットの求核性アミノ酸残基に対してアジド基を導入することを最優先する。そのため、N-acyl-N-alkyl sulfonamideを側鎖部分に有するコロルミシンとオーラシンの合成を継続する。
アジド化が成功すれば、アジド化されたアミノ酸をペプチド化学分析によって同定する。酵素にアジド基を導入できれば、これを反応起点とするクリックケミストリーによってビオチンを接続し、別途調製する金ナノ粒子をビオチンに接着させる。ここまでは2019年度に完了させたいと考えている。
2020年度には、金ナノ粒子を接着した酵素をガラス基板に固定し、超高速カメラと組み合わせたレーザー暗視野顕微鏡による１分子計測に持ち込む。これにより、ターンオーバー中のNqrBの動きを反映した金ナノ粒子のゆらぎを１分子レベルで解析する予定である。
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