| 研究課題/領域番号 |
18H02151
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
永田 宏次 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 准教授 (30280788)
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| 研究分担者 |
鈴木 道生 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 准教授 (10647655)
川上 浩 共立女子大学, 家政学部, 教授 (90458860)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | ラクトフェリン / C型肝炎ウイルス / ノロウイルス / 虫歯菌 / 相互作用解析 / 外被タンパク質 / 表層タンパク質 / 唾液凝集素 |
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| 研究実績の概要 |
・ウイルス外膜タンパク質の発現、精製
HCV外被タンパク質E2について、大腸菌および原虫を宿主とする発現系を構築し、大腸菌を宿主として発現させたE2を精製した。一方、NV外被タンパク質Pdomainについては、大腸菌を宿主とする発現系を構築し、精製系を確立した。
・LFとウイルス外殻／受容体タンパク質の相互作用解析、複合体構造解析
大腸菌で発現し精製したHCV外被タンパク質E2について、LFとの相互作用をプルダウンアッセイによって検出しようと試みたが、検出できていない。E2コンストラクトと結合条件の検討を進めている。一方、大腸菌で発現し精製したNV外被タンパク質Pdomainについては、ヒトのノロウイルス受容体の部分構造であるフコースとの相互作用をプルダウンアッセイによって検出した。さらに等温滴定熱測定（ITC）による定量的相互作用解析においても相互作用を検出できたため、Pdomainの機能を保持した状態で発現・精製に成功したことが示された。現在、解離定数と化学量論（結合する分子数の比）の解析を進めており、その後、PdomainとLFの相互作用解析を行う。
・唾液凝集素タンパク質・虫歯菌表層タンパク質の発現系作製、発現、精製、相互作用解析
唾液凝集素タンパク質のSRCRドメインおよび虫歯菌表層タンパク質のAVPドメインの発現系を構築し、大腸菌で発現、精製した。プルダウンアッセイにより、LFとSRCRドメインとAVPドメインの、どのペア間にも相互作用解析が検出された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
・ウイルス外膜タンパク質の発現、精製
HCV外被タンパク質E2について、精製はできたが、期待されたLFとの相互作用が検出されておらず、機能を有する状態で発現できたかはまだ不明であるため。発現系の改善を進め、機能を有する状態での発現を確定した後に、精製系を確立する。［（3）やや遅れている。］一方、NV外被タンパク質Pdomainについては、発現・精製系を確立し、機能を有することも確認できたため。［（2）おおむね順調に進展している。］
・LFとウイルス外殻／受容体タンパク質の相互作用解析、複合体構造解析
HCV外被タンパク質E2について、LFとの相互作用をプルダウンアッセイによって検出できていないため。E2コンストラクトと結合条件の検討を進める。［（3）やや遅れている。］一方、NV外被タンパク質Pdomainについては、ヒトのノロウイルス受容体の部分構造であるフコースとの相互作用を検出でき、機能を持った状態で発現できたことが確認できたため。解離定数と化学量論（結合する分子数の比）を解析し、続いて、LFとの相互作用解析も行う。［（2）おおむね順調に進展している。］
・唾液凝集素タンパク質・虫歯菌表層タンパク質の発現系作製、発現、精製、相互作用解析
平成31年度に予定していた実験を前倒しして、進めた。唾液凝集素タンパク質も虫歯菌表層タンパク質も、発現・精製に成功し、期待した通りの相互作用が検出されたため。［（2）おおむね順調に進展している。］
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| 今後の研究の推進方策 |
・ウイルス外膜タンパク質の発現、精製
HCV外被タンパク質E2について、機能を有する状態で発現できたかはまだ不明であるため、発現系の改善を進め、機能を有する状態での発現を確定した後に、精製系を確立する。
・LFとウイルス外殻／受容体タンパク質の相互作用解析、複合体構造解析
HCV外被タンパク質E2について、機能を有する状態で発現できたら、LFとの相互作用解析、複合体の精製、共結晶化、複合体の立体構造解析を進める。一方、NV外被タンパク質Pdomainについては、LFとの相互作用解析、複合体の精製、共結晶化、複合体の立体構造解析を進める。
・唾液凝集素タンパク質・虫歯菌表層タンパク質の発現系作製、発現、精製、相互作用解析
唾液凝集素タンパク質SRCRドメイン、虫歯菌表層タンパク質PAc、LFはいずれも相互作用することが示されたので、三種類の二者複合体の精製、共結晶化、複合体の立体構造解析を進める。また、定量的相互作用解析により、各相互作用の強弱の関係を明らかにすることにより、LFが虫歯菌の歯面付着予防に有効であるか否か、分子レベルで検討する。
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