| 研究課題/領域番号 |
18H02214
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
小野 肇 京都大学, 農学研究科, 准教授 (70452282)
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| 研究分担者 |
片岡 宏誌 東京大学, 大学院新領域創成科学研究科, 教授 (60202008)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | ステロイドホルモン / 生合成 / 前胸腺 / ショウジョウバエ / カイコ / 生合成酵素 / S2細胞 |
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| 研究実績の概要 |
昆虫のステロイドホルモンのエクダイソンの生合成経路の全容は未解明のままである。エクダイソンの生合成経路では、食餌由来のコレステロールを出発原料として7-デヒドロコレステロール（7dC）が最初に生合成される。この生合成経路の解明を目指すにあたり、昨年度はエクダイソン欠損ショウジョウバエ幼虫を用いたレスキュー実験と重水素ラベル体ステロイドのカイコ前胸腺培養を行った。その結果、2種類の新規化合物を中間体候補物質と結論付けた。今年度は、生合成酵素の機能解析から、これら2種類の新規化合物が中間体であることの証明を試みた。また、ミバエ科昆虫について、化学受容や生理面から最近の研究動向をまとめて総説を出版した。以下に主要な研究の進展を述べる。
１）既知生合成酵素Shadeを用いたS2細胞での発現実験
生合成酵素の機能解析にあたり、ショウジョウバエ由来のS2細胞を用いて酵素を発現させること計画した。これまでに、シトクロムP450 酸化酵素である Shade がエクダイソンから20-ハイドロキシエクダイソンへの変換を触媒することが明らかにされている。そのため、S2細胞で Shade を発現させて、培養液にエクダイソンを添加してインキュベートした。その後、培養液を処理して LC/MS/MS 分析した結果、20-ハイドロキシエクダイソンを検出した。そのため、Shade の発現および基質変換ができたと判断した。
２）機能未知生合成酵素 Shroud, Spook のS2細胞での発現
機能未知生合成酵素 Shroud, Spook が 7dC を新規化合物へと変換、あるいは新規化合物を既知中間体の ketodiol へと変換していることが考えられる。そのため、S2 細胞でのShroud, Spook の発現を試みた。しかし、酵素発現を発現できなかったうえに基質変換が認められなかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
S2細胞で発現させた既知生合成酵素 Shade によるエクダイソンから20-ハイドロキシエクダイソンへの変換を確認したように、生合成酵素発現系を確立することができた。しかし、研究対象とする未知経路で機能すると考えられる生合成酵素の発現解析には至らなかった。昨年度までは、きわめて順調に研究が進んでいたが、今年度は足踏みしてしまったため進捗状態はやや遅れていると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
機能未知生合成酵素 Shroud, Spook の発現を確認することができなかったため、発現系の条件検討を進める。これまでは、生合成酵素の一過性の発現を試みてきたが、発現量が少ないなどの問題が考えられる。そのため、今後は生合成酵素発現細胞株を確立して、機能解析を試みる。
昨年度、エクダイソンへ変換されることを確認した2種類の新規化合物は複数の立体異性体をもつ。そのため、実際にエクダイソンへ変換される構造を明らかにする必要がある。そのため、有機合成で生じる複数の立体異性体を分離する条件を決定して、各異性体を精製する。精製した異性体について、それぞれの立体配置を決定する。
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