| 研究課題/領域番号 |
18H02275
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
井尻 成保 北海道大学, 水産科学研究院, 准教授 (90425421)
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| 研究分担者 |
足立 伸次 北海道大学, 水産科学研究院, 教授 (40231930)
柴田 安司 帝京科学大学, 生命環境学部, 准教授 (80446260)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 20β-HSD / Hsd17β12L / ウナギ / チョウザメ / ティラピア / メダカ |
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| 研究実績の概要 |
１）ティラピア、メダカ、サクラマスのHsd17β12L：昨年度までに3種ともに17α-ヒドロキシプロゲステロン（17OHP）を17α,20β-ジヒドロキシ-4-プレグネン-3-オン（DHP）に転換する強い20β-HSD活性を証明した。様々なステロイド基質を添加し、17β-HSD活性の有無を調べたところ、いずれの種も17β-HSD活性を持たないことが示された。遺伝子配列は17β-Hsd12および17β-Hsd3に極めて近いものの17β-HSDの名称は不適切であると判断された。
２）チョウザメ類のHsd17β12L：アムールチョウザメの卵成熟誘起ステロイド（MIS）がDHPである可能性が高まったため、チョウザメ類でもHsd17β12L cDNAを単離した。アムールチョウザメから6種単離され、そのうち1種が強い20β-HSD活性を示した。条鰭類全体を通してHsd17β12Lが20β-HSDをコードする遺伝子である可能性が高まった。
３）Hsd17β12L遺伝子ノックアウトの作製：Hsd17β12L遺伝子ノックアウトメダカは変異導入ホモ個体を作製した。Hsd17β12Lにコードされる20β-HSDを持たないメダカの卵成熟過程を解析することが可能になった。
４）Cyp17a1およびCyp17a2遺伝子発現調節機構：ウナギのCyp17a1およびCyp17a2遺伝子上流域5kbを単離した。この下流にルシフェラーゼ遺伝子を組み込み、HEK293T細胞に導入し、LH作用を疑似するサケ脳下垂体抽出物を添加して培養した。Cyp17a2プロモーターはある程度活性化されたものの、Cyp17a1プロモーターの活性抑制は見られなかった。ウナギ卵成熟期に見られるCyp17a1遺伝子発現抑制は本実験系では再現されず、LHシグナル以下に未知の因子が介在している可能性が示された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
１）ティラピア、メダカのHsd17β12L：メダカ、ティラピアのHsd17β12Lの解析が完了し、卵成熟前にHsd17β12L mRNAの発現量が上昇することでDHPが産生され、卵成熟・排卵が誘起されるという機構が共通していた。サクラマスを含めた正真骨団内における普遍性が示された。
２）チョウザメ類のMIHおよびHsd17β12L：アムールチョウザメの血中および卵濾胞培養液の解析からDHPがチョウザメ類のMIHである可能性は高まったもののまだ確定的ではない。アムールチョウザメ、コチョウザメともに複数タイプのHsd17β12L cDNAが単離され、それぞれの20β-HSD活性の有無は明らかにされた。サンプル数は多くはないものの、卵成熟前後において発現が上昇するタイプは見つかっていない。DHPの前駆体である17OHP産生によってDHP産生が調節されている可能性が新たに考えられた。
3）Hsd17β12L遺伝子ノックアウトの作製：メダカのホモ変異個体は作製され、来年度にその卵成熟の有無を含めた卵成熟過程の解析を行うことができる手段を整えることができた。メダカは順調に進捗しているがゼブラフィッシュのノックアウト個体作製は遅れている。
４）Hsd17β12L遺伝子発現調節機構：LH刺激とHsd17β12L遺伝子発現の間には未知因子が介在していることが予想されたが、予想される未知因子の絞り込みには至っていない。
５）Cyp17a1およびCyp17a2遺伝子発現調節機構：ウナギではHsd17β12Lは恒常的に発現しており、卵成熟期に17OHPが産生されることによってDHP産生が調節されていると予想している。本年度LH刺激によって17OHP産生に関わるCyp17a2プロモーターの転写活性が誘導されることが示されたが、Cyp17a1プロモーターの活性抑制の証拠は得られなかった。
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| 今後の研究の推進方策 |
１）チョウザメ類のMIH産生機構：アムールチョウザメとコチョウザメにおいて複数タイプのHsd17β12L cDNAを単離したが、卵成熟過程で発現変動するものは見つからなかった。ウナギ同様に17OHP産生調節によってDHP産生が誘導されている可能性が高まった。17OHP産生に関わるCyp17a1およびCyp17a2についても複数タイプを単離した。今後は、それらの酵素活性を解析し、卵成熟過程での発現変動も調べることで、チョウザメのDHP産生機構を推定する。
２）Hsd17β12L遺伝子ノックアウトの作製：引き続き、メダカホモ変異個体の卵成熟過程および血中DHP量を調べ、Hsd17β12LがDHP産生に必須であるかを調べる。ゼブラフィッシュでは遺伝子変異個体の作製を継続する。
３）Hsd17β12L遺伝子発現調節機構：引き続き、LH刺激とHsd17β12L遺伝子発現との間に介在すると想定される未知因子の候補を、メダカ卵濾胞とサクラマス顆粒膜細胞において卵成熟期に発現上昇する因子の中から探索する。
４）DHPの前駆体である17OHP産生を制御する、ウナギCyp17a1およびCyp17a2遺伝子のプロモーター解析を継続する。当初予定していたバキュロウイルス遺伝子導入系がウナギの卵巣培養で働かないことが分かったため、引き続き培養ホ乳類細胞系での解析を続ける。Cyp17a1プロモーターの活性化因子を探索し、HEK293T細胞中で一旦活性化させた後にLHを高濃度で作用させ、プロモーター活性が抑制されるかを調べる。
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