| 研究課題/領域番号 |
18H02282
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| 研究機関 | 国立研究開発法人水産研究・教育機構 |
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研究代表者 |
松山 知正 国立研究開発法人水産研究・教育機構, 増養殖研究所, グループ長 (20372021)
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| 研究分担者 |
藤原 篤志 国立研究開発法人水産研究・教育機構, 中央水産研究所, 主幹研究員 (30443352)
高野 倫一 国立研究開発法人水産研究・教育機構, 増養殖研究所, 研究員 (40533998)
稲田 真理 国立研究開発法人水産研究・教育機構, 増養殖研究所, 研究員 (50723558) [辞退]
桐生 郁也 国立研究開発法人水産研究・教育機構, 増養殖研究所, 主任研究員 (20443351)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | アワビ / 筋委縮症 / asfivirus / ゲノム |
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| 研究実績の概要 |
クロアワビとメガイアワビにおける原因ウイルスの動態解析と、ウイルスのドラフトゲノム解析を行った。
ウイルスの動態解析では、20℃で発病した病貝の飼育水温を25℃まで上昇させることで、体内のウイルス量が有意に減少することが明らかとなった。また、筋萎縮症はメガイアワビでは発症しないと考えられていたが、メガイにおいても本ウイルスが増殖することを定量PCRにより明らかにした。クロアワビと比較して死亡率は低いものの、メガイにおいても死亡が発生した。本ウイルスのmajor capsid protein遺伝子に対する定量PCRにより、クロアワビ病貝における本ウイルスの体内分布を調査したところ、ウイルス遺伝子は血リンパ液、血球および中腸腺に少なく、その他の組織では概ね同程度に分布していた。同遺伝子に対するin situハイブリダイゼーションにおいても、同様の傾向が認められた。本病は、神経幹の周辺に形成される異常細胞塊が特徴的だが、ウイルス遺伝子は神経幹には存在しなかった。ウイルス感染細胞は筋肉および結合組織に散在し、全身に分布していた。
ドラフトゲノム解析では、粗精製したウイルス分画を次世代シーケンサーにより解読し、リードをアセンブルしたところ本ウイルスを由来とすると考えられる９つのScaffoldが得られた。各Scaffoldの外側に向けてプライマーを設計し、PCRによってギャップを増幅することで、ほぼ全長の配列を決定することができた。現時点では、本ウイルスのゲノムサイズは約210kbpと推定された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
１年目の研究として、①ウイルスの動態解析、②ウイルスに対する宿主の遺伝子発現応答、③ウイルスの全ゲノム解析を予定していた。
①ウイルスの動態解析では、クロアワビおよびメガイにおけるウイルスの増減を調査し、本病に罹患しないと考えられていたメガイも本ウイルスに感染することを明らかにした。申請時の予想とは異なる結果であるが、順調に進捗している。
②ウイルスに対する宿主の遺伝子発現応答解析では、本病に罹患したクロアワビについて網羅的なトランスクリプトームを取得し、現在データを精査している。また、ウイルスが減少する高水温化で飼育した病貝について解析を進めている。全体として順調に進展している。
③ウイルスの全ゲノム解析では、ほぼ全長配列が解読できており、順調に進捗している。
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| 今後の研究の推進方策 |
今年度は、以下の通り①発病と関係する遺伝子応答の解析、②RNA干渉と外来遺伝子発現の条件検討、③ウイルス株間の多型解析、④免疫組織科学染色によるウイルスの動態解析を行う。
①：ウイルスが増殖する低水温と増殖しない高水温で飼育した病貝について、遺伝子発現解析を実施し、発病と関係する宿主およびウイルスの遺伝子をスクリーニングする。②：RNA干渉あるいは発現ベクターの導入により宿主のウイルスに対する応答を人為的に操作することで、本ウイルスに対する抵抗性を操作する実験では、dsRNA等を用いたRNA干渉と、アワビで効率的に外来遺伝子を発現させるための方法について条件検討を行う。RNA干渉では、dsRNA等をアワビに接種し、遺伝子発現の抑制作用を解析する。外来遺伝子の発現では、種々のプロモーター下にGFP遺伝子を連結したベクターをアワビに投与し、蛍光色素の産生を指標に効率的な方法を探索する。③：ウイルス株間の多型解析では、日本各地で発生した本病について、ウイルスのゲノムを次世代シーケンスにより解析し、変異箇所を探索する。 ④：免疫組織科学染色によるウイルスの動態解析では、本ウイルスのmajor capsid proteinの組換タンパク質に対して作成した抗血清を用いて、自然発症アワビや実験感染アワビを染色し、ウイルス抗原の組織分布を解析する。
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