乳腺上皮細胞による細胞遊走因子のエクソソーム依存的分泌機構と乳房炎誘起機序の解明

2018 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 18H02326
• 研究機関: 東北大学
• 研究代表者: 麻生 久 東北大学, 農学研究科, 教授 (50241625)
• 研究分担者: 野地 智法 東北大学, 農学研究科, 准教授 (10708001) ; 渡邊 康一 東北大学, 農学研究科, 助教 (80261494) ; 北澤 春樹 東北大学, 農学研究科, 准教授 (10204885) ; 奥 夏美 (岡田夏美) 東北大学, 農学研究科, 技術一般職員 (10621584)
• 研究期間 (年度): 2018-04-01 – 2021-03-31
• キーワード: ウシ乳房炎 / シクロフィリンA / エクソゾーム / 免疫反応 / 炎症

研究実績の概要

乳腺上皮細胞株を用いて、乳房炎起因に関連する菌体内毒素(リポ多糖)ならびに菌体（黄色ブドウ球菌）刺激による病原体関連分子パターンや乳房炎原因菌を用いた刺激条件の設定が完了し、シクロフィリンA分泌に関連した遺伝子発現変化の網羅的解析が可能となった。乳房炎起因に関連する菌体内毒素ならびに菌体刺激によって変化した因子については、さらに再現性を検証した。乳汁中シクロフィリンAはホエーとエクソソーム分画に存在するが、ELISAではエクソソームに抱合されたシクロフィリンAは検出できないことから、乳汁中体細胞数に対応して変動しているシクロフィリンAはエクソソームに抱合していない単体のシクロフィリンAであることを明らかにした。
良好な増殖能と乳汁分泌分化誘導可能な乳腺上皮細胞株(BME細胞)の培養を開始し、病原体関連分子パターンや乳房炎原因菌や内毒素を用いた刺激条件について設定した。病原体関連分子パターンとしてリポ多糖(LPS)を、また乳房炎原因菌としてSA２株を用い、BMEC細胞刺激における遺伝子発現変化の網羅的解析を進めるため、一次指標となる炎症性サイトカインやケモカインの発現変化を確認しながら、LPS及びSA２株刺激細胞より、解析グレードのRNA試料(RIN=10)を調製してマイクロアレイ解析を行い、発現上昇および減少する因子から変動する免疫関連因子の情報が得られ、発現変動のあった免疫関連の14遺伝子をリストアップし、その発現をリアルタイムPCR法で解析した。

現在までの達成度 (区分)

1: 当初の計画以上に進展している

理由

乳房炎による乳汁中へのシクロフィリンA分泌機構の解明：乳腺上皮細胞株を用いて、乳房炎起因に関連する菌体内毒素(リポ多糖)ならびに菌体（黄色ブドウ球菌）刺激による病原体関連分子パターンや乳房炎原因菌を用いた刺激条件の設定が完了し、シクロフィリンA分泌に関連した遺伝子発現変化の網羅的解析が可能となった。乳房炎起因に関連する菌体内毒素ならびに菌体刺激によって変化した因子については、さらに再現性を検証した。乳汁中シクロフィリンAはホエーとエクソソーム分画に存在するが、ELISAではエクソソームに抱合されたシクロフィリンAは検出できないことから、乳汁中体細胞数に対応して変動しているシクロフィリンAはエクソソームに抱合していない単体のシクロフィリンAであることを明らかにした。以上より、研究は当初の計画以上に進展している。

今後の研究の推進方策

シクロフィリンAは細胞外に放出され、炎症反応における白血球遊走因子ケモカインの一つであることが明らかとなり、乳腺上皮細胞からのエクソソーム依存的なシクロフィリンA分泌機構に加え、シクロフィリンAの樹状細胞によるT細胞調節機構に及ぼす作用を解明することは、シクロフィリンAを含めた白血球遊走因子を乳房炎治療の新たな標的分子とした治療法の開発に繋がり、抗生剤に頼らない乳房炎治療対策の新しい柱となると考えられる。今年度は、以下の研究を行う。
１）健康牛および乳房炎牛の乳からシクロフィリンAを含有したエクソソームを精製し、その粒径と含有されているシクロフィリンAの濃度の比較を行い、健康牛と乳房炎牛における乳汁中のシクロフィリンA含有エクソソームの存在様式を明らかにし、それぞれを健康牛の乳頭孔より投与して乳汁中体細胞数の変動を解析して作用機構を明らかにする。
２）樹立に成功したウシ乳腺上皮細胞株を用いて、乳房炎を誘起させる菌体および菌体成分によるシクロフィリンAの産生機構、およびシクロフィリンAの炎症誘起機構の解析を行う。炎症関連遺伝子の網羅的解析を行い、標的遺伝子についてリアルタイムRT-PCR法により検証する。確立しているin vitroモデル系を用いて、各分化期におけるシクロフィリンAの発現様式の解析に加え、乳房炎原因菌とその毒素によるシクロフィリンAの分泌機構の解析を行う。次に、乳腺上皮細胞の乳房炎原因菌処理からアポトーシスに至る過程の形態的あるいは遺伝子的な変化を詳細に解析する。

研究成果

• [雑誌論文] Genomic Characterization of Lactobacillus delbrueckii TUA4408L and Evaluation of the Antiviral Activities of its Extracellular Polysaccharides in Porcine Intestinal Epithelial Cells (2018)
  • 著者名/発表者名: Paulraj Kanmani, Leonardo Albarracin, Hisakazu Kobayashi, Elvira Maria Hebert, Lucila Saavedra, Ryoya Komatsu, Brian Gatica, Ayako Miyazaki, Wakako Ikeda-Ohtsubo, Yoshihito Suda, Hisashi Aso, Shintaro Egusa, Takashi Mishima, Alexis Salas-Burgos, Hideki Takahashi, Julio Villena and Haruki Kitazawa
  • 雑誌名: Frontiers in Immunology 巻: 9 ページ: 1-16
  • DOI: 10.3389/fimmu.2018.02178
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Development of immune and microbial environments is independently regulated in the mammary gland (2018)
  • 著者名/発表者名: K. Niimi, K. Usami, Y. Fujita, M. Abe, M. Furukawa, Y. Suyama, Y. Sakai, M. Kamioka, N. Shibata, E.J. Park, S. Sato, H. Kiyono, H. Yoneyama, H. Kitazawa, K. Watanabe, T. Nochi and H. Aso
  • 雑誌名: Mucosal Immunology 巻: 11 ページ: 643-653
  • DOI: 0.1038/mi.2017.90
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Phenotypic and functional analysis of bovine peripheral blood dendritic cells before parturition by a novel purification method (2018)
  • 著者名/発表者名: Tao Zhuang, Megumi Urakawa, Hidetoshi Sato, Yuko Sato, Teruaki Taguchi, Tsuyoshi Umino, Shiro Katto, Koutaro Tanaka, Kozue Yoshimura, Naokazu Takada, Hiroko Kobayashi, Megumi Ito, Michael T. Rose, Yoshio Kiku, Yuya Nagasawa, Haruki Kitazawa, Kouichi Watanabe, Tomonori Nochi, Tomohito Hayashi and Hisashi Aso
  • 雑誌名: ANIMAL SCIENCE JOURNAL 巻: 89 ページ: 1011-1019
  • DOI: 10.1111/asj.13014
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Immunobiotics for the Bovine Host: Their Interaction with Intestinal Epithelial Cells and Their Effect on Antiviral Immunity (2018)
  • 著者名/発表者名: Julio Villena, Hisashi Aso, Victor P. M. G. Rutten, Hideki Takahashi, Willem van Eden and Haruki Kitazawa
  • 雑誌名: Frontiers in Immunology 巻: 9 ページ: 1-10
  • DOI: 10.3389/fimmu.2018.00326
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Identification of a novel mechanism of action of bovine IgG antibodies specific for Staphylococcus aureus (2018)
  • 著者名/発表者名: Furukawa M, Yoneyama H, Hata E, Iwano H, Higuchi H, Ando T, Sato M, Hayashi T, Kiku Y, Nagasawa Y, Niimi K, Usami K, Ito K, Watanabe K, Nochi T, Aso H
  • 雑誌名: Veterinary Research 巻: 49 ページ: 22-33
  • DOI: 10.1186/s13567-018-0517-y
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] Intestinal microflora changes during lactation and has relevance to the specificity of milk IgA and diversity of microflora in the mammary gland (2018)
  • 著者名/発表者名: Niimi K, Usami K, Furukawa M, Sasaki S, Watanabe K, Aso H, Nochi T.
  • 学会等名: Mucosal Immunology Course & Symposium (MICS2018), Oxford, UK
  • 国際学会
• [学会発表] CCL28-mediated chemotaxis for the recruitment of IgA-producing plasma cells into the mammary gland depends on the lactation-related but not bacterial stimulus (2018)
  • 著者名/発表者名: Nochi T, Niimi K, Usami K, Furukawa M, Sasaki S, Kiyono H, Watanabe K, Aso H.
  • 学会等名: Mucosal Immunology Course & Symposium (MICS2018), Oxford, UK
  • 国際学会
• [学会発表] シクロフィリンＡの乳頭投与が乳汁中体細胞数に与える影響 (2018)
  • 著者名/発表者名: 佐藤佑子・吉村 梢・浦川めぐみ・庄 涛・田中孝太朗・遠藤佑真・伊藤 愛・小堤知行・小林宏子・高田直和・渡邊康一・野地智法・麻生 久
  • 学会等名: 東北畜産学会第68回大会
• [学会発表] Effect of probiotic Bacillus Subtilis C-3102 strain on function of dendritic cells in bovine peripheral blood before and after parturition (2018)
  • 著者名/発表者名: Zhuang T, Urakawa M, Sato H, Kobayashi H, Sato Y, Ashida N, Otomo N, Watanabe K, Nochi T, Aso H.
  • 学会等名: The 30th World Buiatrics Congress, Sapporo, Japan
  • 国際学会
• [学会発表] Oral feeding with a probiotics Bacillus subtilis C-3102 modulates the immune and metabolic functions in dairy cattle, resulting in prevention of mastitis (2018)
  • 著者名/発表者名: Urakawa M, Sato H, Zhuang T, Taguchi T, Katto S, Tanaka K, Kobayashi H, Ito M, Sato Y, Ashida N, Otomo N, Watanabe K, Nochi T, Aso H.
  • 学会等名: The 30th World Buiatrics Congress, Sapporo, Japan
  • 国際学会
• [学会発表] ウシ乳房炎誘起因子シクロフィリンＡの乳汁における存在様式 (2018)
  • 著者名/発表者名: 吉村 梢・海野 剛・浦川めぐみ・庄 涛・田中孝太朗・遠藤佑真・佐藤佑子・小堤知行・佐藤秀俊・渡邊康一・野地智法・麻生 久
  • 学会等名: 日本獣医学会第161回大会
• [学会発表] パイエル板から乳腺に遊走するIgA産生細胞の同定 (2018)
  • 著者名/発表者名: 宇佐美克紀・新實香奈枝・佐々木志保・馬場柚里・古川睦実・伊藤 駿・渡邊康一・麻生 久・野地智法
  • 学会等名: 日本獣医学会第161回大会
• [学会発表] 早期診断法開発とプロバイオティクス飼料による乳房炎発症制御 (2018)
  • 著者名/発表者名: 麻生 久
  • 学会等名: 第49回日本家畜臨床学会
  • 招待講演
• [備考] 東北大学大学院農学研究科 機能形態学分野
  • URL: http://www.agri.tohoku.ac.jp/keitai/index-j.html
• [備考] 東北大学大学院農学研究科 食と農免疫研究教育センター
  • URL: http://www.agri.tohoku.ac.jp/cfai/index.html
• [備考] 研究拠点形成事業 先端拠点形成
  • URL: http://www.agri.tohoku.ac.jp/fain/index.html