• 研究課題をさがす
  • 研究者をさがす
  • KAKENの使い方
  1. 課題ページに戻る

2018 年度 実績報告書

家畜病原性原虫ネオスポラの感染による流産発症機構の解明

研究課題

研究課題/領域番号 18H02335
研究機関帯広畜産大学

研究代表者

西川 義文  帯広畜産大学, 原虫病研究センター, 教授 (90431395)

研究期間 (年度) 2018-04-01 – 2021-03-31
キーワード原虫 / ネオスポラ / 流産 / 病原性
研究実績の概要

農場経営を進める上で病原性原虫ネオスポラの感染による流産に注意する必要がある。しかしネオスポラに対するワクチンや治療薬は実用化されていないため、ネオスポラ誘発性流産の発症メカニズムの理解に基づく防御方法の開発が必要とされる。そこで、「原虫由来の流産誘発因子が存在し、妊娠子宮での環境を変化させることで胎盤の炎症、壊死が誘発され流産が起こる」という仮説を立てた。本研究では、感染マウスの流産モデルを確立し、原虫側および宿主側の流産誘発因子の特定を行い、その証明を試みる。ネオスポラの流産誘発因子の同定および流産発生のメカニズムの解明は、ワクチンを含めた流産の予防法の開発において極めて重要な科学的知見を提供することができ、本疾病対策へ大きく貢献できる。平成30年度は以下の項目を明らかにした。
【妊娠期感染モデルの確立およびその病態解析】ネオスポラ感染マウスの妊娠期モデルを確立し、流産あるいは異常妊娠発症時における免疫応答および組織学的変化を病理組織学的に解析した。本感染モデルにおいて、ネオスポラ感染による流産及び胎児異常が確認され、病理組織学的検索により子宮胎盤組織における炎症が確認された。
【妊娠子宮組織のmRNA発現解析】 流産モデルの胎盤組織を採材し、mRNAの発現解析を行なった。ネオスポラ感染により胎盤組織における炎症が確認されたため、炎症マーカーについて非感染マウスとの比較解析を行い、炎症性サイトカインとケモカインの発現が増加していることが明らかとなった。
【原虫由来流産誘発因子のスクリーニング】
前述の解析結果で炎症反応に関わる宿主シグナルの関与が示唆されたため、免疫反応に対応したプロモーター制御下でルシフェラーゼを発現するプラスミドを用い、当該シグナルを活性化させる原虫遺伝子をスクリーニングし、候補分子としてNcGRA7を見出した。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

【妊娠期感染モデルの確立およびその病態解析】C57BL/6マウスとBLAB/cマウスを用いて、ネオスポラの妊娠期感染による妊娠・出産の影響を解析した。原虫の感染数と感染させる妊娠期を検討したところ、C57BL/6マウスの妊娠3日目に100万個原虫を感染させると流産や胎児異常が80%の割合で認められた。病理組織学的検索の結果、前述の感染マウスの胎盤組織において炎症が認められた。妊娠13日目に前述の感染マウス及び非感染マウスの胎盤及び脾臓を採材し、リアルタイムPCRによるmRNA発現の相対比較を行った。胎盤組織ではネオスポラの感染により炎症性サイトカインのIFN-g及び各種ケモカイン(CCL2, CCL8, CXCL9)の発現が増加していた。一方脾臓組織では、原虫の感染により炎症性サイトカインTNF-αの発現が現象し、ケモカインCCL9の発現が増加していた。
【原虫由来流産誘発因子のスクリーニング】過剰な炎症反応の惹起や炎症性細胞の遊走に影響を与える宿主遺伝子の発現を増強させるネオスポラ分子をルシフェラーゼアッセイ法によりスクリーニングし、候補分子としてNcGRA7を同定した。
以上の結果より、NcGRA7は炎症反応の誘導に伴う組織障害に関与していることが推測された。これらの結果が示すように、本研究課題の進捗状況は当初の予定通りおおむね順調に進展していると判断した。

今後の研究の推進方策

今後は以下の項目を実施する。
【流産誘発因子破壊原虫の作製とin vitroでの性状解析】スクリーニングした原虫因子を流産誘発因子の候補とし、「CRISPR-Cas9によるネオスポラの遺伝子編集技術」を用いて当該遺伝子を破壊した原虫を作製する。樹立した原虫因子破壊株は、細胞侵入能・脱出活性能、増殖率の性状解析を行い、子宮平滑筋細胞や栄養膜細胞の細胞株へ感染させ、サイトカイン・ケモカイン産生の有無、シグナル経路の変化を検証する。
【流産誘発因子破壊原虫を用いたマウス感染実験による妊娠期の病態解析】活性が確認された原虫因子について、その原虫因子破壊株を非妊娠雌マウスへ感染させ、マウスの生存率と組織の病理組織学的、免疫組織化学的解析を実施し、野生型原虫の感染での結果と比較することで、遺伝子破壊による原虫の病原性の変化を解析する。
【流産誘発因子と相互作用する宿主因子の同定】FLAGタグ融合原虫因子を遺伝子欠損原虫へ導入した原虫株を作製する、この原虫株を栄養膜細胞の細胞株へ感染させ、そのライセートをFLAGタグ抗体で免疫沈降し、質量分析(MALDI-TOF-MSあるいはnanoLC-MS/MS)により結合タンパク質を同定する。
【ネオスポラ流産牛の組織サンプルを用いた流産誘発因子および宿主因子の同定】
以上の研究課題により同定された原虫由来流産誘発因子と宿主因子について、ネオスポラ流産牛の組織サンプル(胎盤、流産胎児等)における発現を確認する。

  • 研究成果

    (20件)

すべて 2019 2018 その他

すべて 国際共同研究 (3件) 雑誌論文 (7件) (うち国際共著 7件、 査読あり 7件、 オープンアクセス 1件) 学会発表 (5件) (うち招待講演 1件) 備考 (5件)

  • [国際共同研究] South Valley大学(エジプト)

    • 国名
      エジプト
    • 外国機関名
      South Valley大学
  • [国際共同研究] モンゴル生命科学大学(モンゴル)

    • 国名
      モンゴル
    • 外国機関名
      モンゴル生命科学大学
  • [国際共同研究] マヒドン大学(タイ)

    • 国名
      タイ
    • 外国機関名
      マヒドン大学
  • [雑誌論文] Neospora GRA6 possesses immune-stimulating activity and confers efficient protection against Neospora caninum infection in mice.2019

    • 著者名/発表者名
      Fereig RM, Shimoda N, Abdelbaky HH, Kuroda Y, Nishikawa Y.
    • 雑誌名

      Vet Parasitol.

      巻: 267 ページ: 61-68

    • DOI

      10.1016/j.vetpar.2019.02.003.

    • 査読あり / 国際共著
  • [雑誌論文] Critical role of TLR2 in triggering protective immunity with cyclophilin entrapped in oligomannose-coated liposomes against Neospora caninum infection in mice.2019

    • 著者名/発表者名
      Fereig RM, Abdelbaky HH, Kuroda Y, Nishikawa Y.
    • 雑誌名

      Vaccine

      巻: 37 ページ: 937-944

    • DOI

      10.1016/j.vaccine.2019.01.005.

    • 査読あり / 国際共著
  • [雑誌論文] Seroprevalence of Cryptosporidium parvum and Neospora caninum in cattle in the southern Kyushu region of Japan.2018

    • 著者名/発表者名
      Masatani T, Fereig RM, Otomaru K, Ishikawa S, Kojima I, Hobo S, Nishikawa Y.
    • 雑誌名

      Parasitol Int.

      巻: 67 ページ: 763-767

    • DOI

      10.1016/j.parint.2018.08.001.

    • 査読あり / 国際共著
  • [雑誌論文] Seroprevalence of Toxoplasma gondii and Neospora caninum infections in cattle in Mongolia.2018

    • 著者名/発表者名
      Pagmadulam B, Myagmarsuren P, Fereig RM, Igarashi M, Yokoyama N, Battsetseg B, Nishikawa Y.
    • 雑誌名

      Vet Parasitol Reg Stud Reports.

      巻: 14 ページ: 11-17

    • DOI

      10.1016/j.vprsr.2018.08.001.

    • 査読あり / 国際共著
  • [雑誌論文] Neospora caninum dense granule protein 7 regulates pathogenesis of neosporosis by modulating host immune response.2018

    • 著者名/発表者名
      Nishikawa Y*, Shimoda N, Fereig RM, Moritaka T, Umeda K, Nishimura M, Ihara F, Kobayashi K, Himori Y, Suzuki Y, Furuoka H.
    • 雑誌名

      Appl Environ Microbiol.

      巻: 84 ページ: e01350-18

    • DOI

      10.1128/AEM.01350-18.

    • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
  • [雑誌論文] Identification of the antigenic region of Neospora caninum dense granule protein 7 using ELISA.2018

    • 著者名/発表者名
      Abdelbaky HH, Fereig RM, Nishikawa Y
    • 雑誌名

      Parasitol Int.

      巻: 67 ページ: 675-678

    • DOI

      10.1016/j.parint.2018.06.012.

    • 査読あり / 国際共著
  • [雑誌論文] Current situation of Neospora caninum and Toxoplasma gondii infection among beef cattle in Kanchanaburi, Ratchaburi and Nakhon Patom provinces, Thailand.2018

    • 著者名/発表者名
      Ruenruetai Udonsom, Yaowalark Sukthana, Yoshifumi Nishikawa, Ragab M. Fereig, Charoonluk Jirapattharasate.
    • 雑誌名

      The Thai Journal of Veterinary Medicine

      巻: 48 ページ: 403-409

    • 査読あり / 国際共著
  • [学会発表] Development of potent and safe vaccine candidates against Neospora caninum infection.2018

    • 著者名/発表者名
      Ragab Fereig、西川義文
    • 学会等名
      第162回日本獣医学会学術集会
    • 招待講演
  • [学会発表] Sero-epidemiological study of Toxoplasma gondii and Neospora caninum infections in cattle in Mongolia.2018

    • 著者名/発表者名
      Pagmadulam Baldorj、Myagmarsuren Punsantsogvoo、Ragab Fereig、五十嵐 慎、横山 直明、Battsetseg Badgar、西川 義文
    • 学会等名
      第161回日本獣医学会学術集会
  • [学会発表] Neospora caninumの病原性因子の同定2018

    • 著者名/発表者名
      西川義文
    • 学会等名
      第26回分子寄生虫学ワークショップ/第16回分子寄生虫・マラリア研究フォーラム合同大会
  • [学会発表] Evaluation of serodiagnostic antigens of Neospora caninum for bovine neosporosis.2018

    • 著者名/発表者名
      Hanan H. Abdelbaky, Maki Nishimura, Naomi Shimoda, Jun Hiasa, Hiromi Tokimitsu, Hisashi Inokuma, Yoshifumi Nishikawa
    • 学会等名
      第 64 回日本寄生虫学会・日本衛生動物学会 北日本支部合同大会
  • [学会発表] ネオスポラ症の病態に関与するNcGRA6 の機能解析2018

    • 著者名/発表者名
      森高智弥, 下田直美, 西川義文
    • 学会等名
      第 64 回日本寄生虫学会・日本衛生動物学会 北日本支部合同大会
  • [備考] 帯広畜産大学・原虫病研究センター

    • URL

      http://www.obihiro.ac.jp/~protozoa/index.html

  • [備考] 帯広畜産大学・原虫病研究センター・生体防御学分野・西川研究室

    • URL

      https://sites.google.com/site/nishihdlab/

  • [備考] 帯広畜産大学

    • URL

      https://www.obihiro.ac.jp

  • [備考] 未踏の領野に挑む、知の開拓者たち vol.61

  • [備考] http://shochou-kaigi.org/interview/interview_61/

URL: 

公開日: 2021-01-27  

サービス概要 検索マニュアル よくある質問 お知らせ 利用規程 科研費による研究の帰属

Powered by NII kakenhi