| 研究課題/領域番号 |
18H02353
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| 研究機関 | 神戸大学 |
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研究代表者 |
李 智博 神戸大学, 農学研究科, 准教授 (50372660)
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| 研究分担者 |
平谷 伊智朗 国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, チームリーダー (40583753)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 減数分裂 / コヒーシン / 精母細胞 / 相同染色体 / 対合 |
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| 研究実績の概要 |
近年，姉妹染色分体の接着を担うコヒーシンの研究により，減数分裂の染色体分離を制御する分子メカニズムの概要はわかってきたが，減数分裂において相同染色体がどのようにお互いを認識し，結合を確立するか，そのメカニズムは解明されていない。本申請課題では，申請者が発見したRAD21LとREC8の2種類の減数分裂特異的コヒーシンサブユニットに着目して，相同染色体間の結合の分子基盤を明らかにすることを目的としている。
本年度は，連携研究者の堀居(群馬大学)との共同研究により，RAD21L, REC8のコヒーシンサブユニットに3×FLAGタグが付加された状態で発現するノックインマウスの作製を試みた。CRISPR/Cas9によるゲノム編集技術を利用してStopコドン近辺に二本鎖切断を誘導し，ssODNにより3×FLAGタグをコードする塩基配列をゲノム上の目的の位置に挿入した。シークエンス解析の結果，数匹のファウンダーマウスにおいて，デザイン通りに3×FLAGをコードする塩基配列の挿入が確認された。現在，野生型マウスとの交配により，ノックイン系統の樹立を図るとともに，REC8-3×FLAGタンパク質やRAD21L-3×FLAGタンパク質の発現状態を調べている。
また，体細胞における減数分裂特異的コヒーシンサブユニットの異所発現の影響を調べるために，複数のサブユニットを同時に発現させる実験系の立ち上げを試みた。手法としては，複数のプラスミドの同時トランスフェクション，単一プラスミドによる複数遺伝子の発現を検討中だが，十分な発現効率の得られる系の立ち上げまでには至っていない。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
ゲノム編集によるノックインマウス作製後の一次スクリーニングとその後の系統の確立のための交配などに，予想以上に時間と労力がかかったため。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後，研究課題の推進のために，作製したノックインマウスにおける3×FLAGタグ付きタンパク質の発現状態を調べ，野生型と同様の発現および機能を示す場合には，抗FLAG抗体を使用してノックインマウスの精巣からコヒーシン複合体を精製し，電子顕微鏡による観察やLC-MS/MS解析による相互作用分子の同定を行う。また，同抗体を使用した全ゲノムクロマチン免疫沈降シークエンス法により，ゲノム上のコヒーシンタンパク質の局在位置の特定を試みる。
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