| 研究課題/領域番号 |
18H02380
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| 研究機関 | 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 |
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研究代表者 |
吉川 学 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 生物機能利用研究部門, 上級研究員 (80391564)
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| 研究分担者 |
西野 達哉 東京理科大学, 基礎工学部生物工学科, 准教授 (50533155)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 小分子RNA / 二次的siRNA |
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| 研究実績の概要 |
植物には小分子RNAとAGRONAUTEを含む複合体RISCによって切断されたRNAを鋳型に二本鎖RNAが合成され、それをDICER-LIKEが切断し、新生siRNA(二次的siRNAと呼ばれる)を生成するRNAサイレンシング増幅機構がある。この機構は内在性の二次的siRNAであるtrans-acting siRNA生成やウイルス防御に機能することがわかっている。二次的siRNA生成は線虫でも知られているが、植物では生化学的な解析が進んでいないため、線虫に比べて詳細な分子機構は不明である。本研究では、植物におけるRNAサイレンシング増幅機構の分子メカニズムを解明することを目的に行う。
我々は、植物の培養細胞抽出液を用いて、RISCによるRNA切断から二次的siRNAを生成させる試験管内系を確立した。抽出液に二次的siRNA生成に必須であることが遺伝学的に示されているタンパク質について組換えタンパク質を調製し、それを加えたところいくつかのタンパク質で二次的siRNAで生成量が亢進されることがわかった。またそれらのタンパク質を過剰に発現する形質転換体シロイヌナズナを作出し、trans-acting siRNAの蓄積を量を調べたが、蓄積量に変化は見られなかった。さらに、それらの詳細な分子機構を解明するために構造解析を進めているが、本年度はそれらの結晶化条件を調べるために十分な組換えタンパク質が得られる発現条件や精製条件を検討した。その結果、組換えタンパク質の収量や精製純度が改善される可能性を示唆する条件がわかった。次年度以降、結晶化の条件検討を行う予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
試験管内系による二次的siRNAの生化学解析は、計画していた実験を概ね行えたが、組換えタンパク質が十分量得られなかったため当初計画していたsmall RNA-Seqが行えなかったので、次年度に遅らせることになった。同様に構造解析についても組換えタンパク質の調製において、計画より進捗が遅れ気味である。
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| 今後の研究の推進方策 |
組換えタンパク質の調製において、宿主や発現ベクター、温度、コドンの最適化などの検討を行う。試験管内系による二次的siRNAの生化学解析については、ドミナントネガティブを示す変異体やウイルスサプレッサーを用いた解析を進める予定である。これまでのところ、当初予定していた研究計画を大きく変更する必要は無い。
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