| 研究課題/領域番号 |
18H02389
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
有森 貴夫 大阪大学, 蛋白質研究所, 助教 (80582064)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 細胞接着 / 細胞外マトリックス |
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| 研究実績の概要 |
細胞外マトリックス中のラミニンと細胞膜上の受容体であるインテグリンを介した細胞接着は，細胞の増殖や分化など様々な細胞活動に関与する細胞生存に欠かせないイベントであるが，その分子認識機構の研究はインテグリンファミリー分子の中でも最も遅れている．その理由の一つは，これらの分子の立体構造情報がほとんどないためである．本研究では，インテグリン-ラミニン複合体の立体構造を明らかにし，その分子認識機構を詳細に解明することを目的とする．
インテグリンとラミニンの複合体の立体構造を決定するためには，安定な複合体試料を得ること，そして構造が均一な試料を得ることが重要である．しかし，インテグリンとラミニンの間の結合は，両者だけで安定な複合体が形成されるほど強くはない．そこで，安定な複合体試料を調製するためには，インテグリン活性化抗体（フラグメント化抗体）やインテグリン活性化因子であるMnイオンの添加が必要である．平成30年度は，2種の抗インテグリン抗体（うち1種は活性化抗体）について，研究代表者が開発した安定なフラグメント抗体フォーマットである“Fv-clasp”に変換した試料を調製した．これらのFv-clasp試料およびMnイオンを様々な組み合わせでインテグリン，ラミニン混合試料に添加し，安定な複合体を形成する条件を網羅的に調べた結果，最適な条件を見出すことに成功した．さらに，この複合体試料を用いて結晶化スクリーニングを実施したところ，複数の条件で結晶が得られた．現在までに構造決定を行えるようなデータの取得には至っていないが，結晶が目的複合体のものであることは，結晶溶解試料の電気泳動で確認できている．インテグリン-ラミニン複合体試料については過去に全く結晶が得られていなかったことから，現在得られている複合体試料は，比較的構造が均一で，構造解析に適していることが示唆された．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
目的タンパク質の安定な複合体試料が得られ，結晶化にも成功しており，目的複合体試料の構造決定に向けて大きく前進した．
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| 今後の研究の推進方策 |
得られた複合体試料について，引き続き結晶化条件の最適化を行っていく．またそれと並行して，クライオ電子顕微鏡を用いた構造決定も試みる．当初はX線結晶構造解析による高分解能での構造決定を目標としていたが，近年，クライオ電子顕微鏡でも高分解能の立体構造決定が可能になってきたこと，研究代表者の所属機関内にある高性能クライオ電子顕微鏡Titan Kriosが利用可能であること，さらには目的タンパク質にフラグメント抗体を結合させたことにより電子顕微鏡での観察が十分可能なサイズの試料が得られたことなどから，クライオ電子顕微鏡での構造解析も試みることにした．また，複合体の構造が得られた後は，構造の妥当性を証明するための変異体実験等を実施していく．
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