セグメント重水素化中性子散乱法による天然変性タンパク質の動的構造解析

2020 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 18H02391
• 研究機関: 横浜市立大学
• 研究代表者: 佐藤 衛 横浜市立大学, 生命医科学研究科, 教授 (60170784)
• 研究分担者: 小田 隆 立教大学, 理学部, 助教 (00573164)
• 研究期間 (年度): 2018-04-01 – 2021-03-31
• キーワード: 天然変性タンパク質 / 中性子小角散乱 / セグメント重水素化

研究実績の概要

本研究では、インテインを用いたドメイン連結法によりセグメント重水素化タンパク質を調製し、逆転コントラスト同調法を用いた中性子小角散乱法により天然変性領域をもつマルチドメインタンパク質の動的構造を解析する。そして、天然変性タンパク質の高度な分子認識・機能発現機構の解明を目指す。対象とするHefタンパク質はN末端側とC末端側に2つの折れ畳まったドメインを持ち、その間に長大な天然変性領域でつながれた構造が存在し、DNAの修復に関与する。2020年度は、以下の(1),(2),(3)を実施した。2019年度までにHefの天然変性領域とC末端側ドメインの連結に成功していたため、(1) 2020年度はN末端側ドメインと天然変性領域の連結を検討し、連結試料を大量調製することができた。インテインによるドメイン連結では連結部位のアミノ酸がCysに一残基置換された配列となる。そこで(2)ドメイン連結ではない通常の全長タンパク質と全体のコンフォメーションに違いがないことをX線小角散乱解析により確認した。本研究では新規手法である逆転コントラスト同調法を利用するが、不可視化したいN末端側、C末端側ドメインを正確に75%重水素化する必要がある。タンパク質重水素化プロトコールは2019年度に検討済みであったが、ドメインによって重水素化率に5~10%のずれがあることが判明したため、(3)重水素化プロトコールを再度検討し、質量分析により正確な重水素化率を確認するプロトコールを確立した。コロナ禍により特に海外の中性子実験施設を全く利用できなかったため、最終的な中性子小角散乱データを用いた解析はできていない。しかし、それ以外の試料調製やX線小角散乱データを用いた予備的な動的構造解析は完了し、機能との関連を示唆する構造アンサンブルが得られており、中性子実験再開後の研究成果が期待される。

現在までの達成度 (段落)

令和2年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

令和2年度が最終年度であるため、記入しない。

研究成果

• [雑誌論文] Serine 298 Phosphorylation in Linker 2 of UHRF1 Regulates Ligand-Binding Property of Its Tandem Tudor Domain (2020)
  • 著者名/発表者名: Kori Satomi, Jimenji Tomohiro, Ekimoto Toru, Sato Miwa, Kusano Fumie, Oda Takashi. Unoki Motoko, Ikeguchi Mitsunori, Arita Kyohei
  • 雑誌名: Journal of Molecular Biology 巻: 432 ページ: 4061-4075
  • DOI: 10.1016/j.jmb.2020.05.006
  • 査読あり
• [雑誌論文] Structural and dynamics analysis of intrinsically disordered proteins by high-speed atomic force microscopy (2020)
  • 著者名/発表者名: Kodera Noriyuki, Noshiro Daisuke, Dora Sujit K., Mori Tetsuya, Habchi Johnny, Blocquel David, Gruet Antoine, Dosnon Marion, Salladini Edoardo, Bignon Christophe, Fujioka Yuko, Oda Takashi, Noda Nobuo, Sato Mamoru, Lotti Marina, Mizuguchi Mineyuki, Longhi Sonia, Ando Toshio
  • 雑誌名: Nature Nanotechnology 巻: 16 ページ: 181-189
  • DOI: 10.1038/s41565-020-00798-9
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Dynamics of proteins with different molecular structures under solution condition (2020)
  • 著者名/発表者名: Inoue Rintaro, Oda Takashi, Nakagawa Hiroshi, Tominaga Taiki, Saio Tomohide, Kawakita Yukinobu, Shimizu Masahiro, Okuda Aya, Morishima Ken, Sato Nobuhiro, Urade Reiko, Sato Mamoru, Sugiyama Masaaki
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 10 ページ: 21678
  • DOI: 10.1038/s41598-020-78311-4
  • 査読あり / オープンアクセス