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2019 年度 実績報告書

複製因子の翻訳後修飾が制御する新しいDNAメチル化継承機構の構造基盤

研究課題

研究課題/領域番号 18H02392
研究機関横浜市立大学

研究代表者

有田 恭平  横浜市立大学, 生命医科学研究科, 准教授 (40549648)

研究分担者 西山 敦哉  東京大学, 医科学研究所, 准教授 (50378840)
研究期間 (年度) 2018-04-01 – 2021-03-31
キーワードDNAメチル化 / ユビキチン / DNA複製 / エピジェネティクス / 構造生物学
研究実績の概要

哺乳類のCpG配列中のシトシン塩基のメチル化は、遺伝子サイレンシング、ゲノムインプリンティング、X染色体不活化、トランスポゾンの発現抑制など様々な生命現象に関与する。DNAメチル化は細胞形質を決定するので、哺乳類が多種多様な細胞集団を維持するためにはDNAメチル化パターンが次世代に正確に受け継がれていく必要がある。本研究ではDNA維持メチル化に必須の因子であるDNAメチル化酵素DNMT1とユビキチンE3酵素UHRF1に焦点をあて、DNA維持メチル化の基本原理の解明を目指す。これまでに、UHRF1によってユビキチン化されたヒストンH3がDNMT1をメチル化DNAに呼び込む分子機構を解明した。本申請ではDNA複製因子によるDNA維持メチル化の制御に着目して研究を行った。
これまでにK126がメチル化された複製因子LIG1(LIG1K126me3)とUHRF1のTTDドメインとの複合体の結晶構造解析に成功した。この構造からTTDのArg-Binding CavityにLIG1のArg121が入り込むことが、UHRF1とLIG1の高親和性の相互作用に重要であることを解明した。このArg-Binding Cavityに入り込む化合物はUHRF1の機能を阻害すると考えられる。本年度は、TTDのArg-Binding Cavityに結合する化合物の探索に向けた研究を行った。
複製因子PAF15がUHRF1によってユビキチン化され、DNMT1を複製サイトに呼び込むことを発見した。さらにDNA維持メチル化には2つのモードがあることがわかり、PAF15はDNA複製後に直ちに起こるDNA維持メチル化に重要であることを解明した。本研究成果は、Nature Communicationsに採択された。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

【UHRF1 TTDドメインに結合する化合物の探索】
構造生物学的な観点から、UHRF1 TTDと化合物の相互作用を解析することを目指し、TTD単独の結晶化条件の探索を行った。30 mg/ml TTDを用いて、最適化した結晶化Bufferで再現よくTTD単独の結晶が得られた。大型放射光施設Photon FactoryでX線回折実験を行い1.8Å分解能の回折強度データを得た。分子置換法で位相決定後、構造解析を行った。結晶中のTTDはArg-binding Cavityに溶媒側から低分子化合物がアクセスできるパッキングをしており、ソーキング法による化合物との複合体の調製に適した配向でTTDが結晶化していることがわかった。さらに、in silico screeningによりTTDのArg-Binding cavityを標的にした化合物の探索を行い、7種類の化合物を選別した。
【複製因子PAF15による新しいDNA維持メチル化の制御機構を解明】
ユビキチン化されたPAF15がDNA複製の直後に起こるDNA維持メチル化を行い、これまで知られていたユビキチン化H3はDNA複製から遅れたDNA維持メチル化を行うことを明らかにした。これによりDNAメチル化維持の堅牢性が保たれている。さらに予備的にユビキチン化PAF15がPCNAのsliding速度を制御することを明らかにしており、これの構造生物学的な知見を得るためにクライオ電子顕微鏡による観察を行った。

今後の研究の推進方策

UHRF1は様々ながん細胞で高発現し、がん抑制遺伝子などの発現に異常をもたらす。このことからUHRF1はがんの薬剤開発の標的分子になると考えられている。2019年度にUHRF1のTTDに結合する候補化合物をin silico screeningで行ったので、これらを入手しThermal shift assayや競合ペプチドを用いた蛍光変更解消実験によって化合物との結合を実験的に評価する。
2019年度にユビキチン化PAF15による新たな機能を生化学的な実験で見出したので、これを構造生物学的な観点から解明する。予備的にクライオ電子顕微鏡観察による構造解析を進めているので、今後は観察を継続して行っていく。

  • 研究成果

    (16件)

すべて 2020 2019 その他

すべて 国際共同研究 (2件) 雑誌論文 (3件) (うち国際共著 1件、 査読あり 3件、 オープンアクセス 1件) 学会発表 (8件) (うち国際学会 4件) 備考 (3件)

  • [国際共同研究] CNRS(フランス)

    • 国名
      フランス
    • 外国機関名
      CNRS
  • [国際共同研究] ミュンヘン大学(ドイツ)

    • 国名
      ドイツ
    • 外国機関名
      ミュンヘン大学
  • [雑誌論文] Two distinct modes of DNMT1 recruitment ensure stable maintenance DNA methylation2020

    • 著者名/発表者名
      Nishiyama Atsuya、Mulholland Christopher B.、Bultmann Sebastian、Kori Satomi、Endo Akinori、Saeki Yasushi、Qin Weihua、Trummer Carina、Chiba Yoshie、Yokoyama Haruka、Kumamoto Soichiro、Kawakami Toru、Hojo Hironobu、Nagae Genta、Aburatani Hiroyuki、Tanaka Keiji、Arita Kyohei、Leonhardt Heinrich、Nakanishi Makoto
    • 雑誌名

      Nature Communications

      巻: 11 ページ: 1222

    • DOI

      10.1038/s41467-020-15006-4

    • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
  • [雑誌論文] Enhanced processivity of Dnmt1 by monoubiquitinated histone H32019

    • 著者名/発表者名
      Mishima Yuichi、Brueckner Laura、Takahashi Saori、Kawakami Toru、Otani Junji、Shinohara Akira、Takeshita Kohei、Garvilles Ronald Garingalao、Watanabe Mikio、Sakai Norio、Takeshima Hideyuki、Nachtegael Charlotte、Nishiyama Atsuya、Nakanishi Makoto、Arita Kyohei、Nakashima Kinichi、Hojo Hironobu、Suetake Isao
    • 雑誌名

      Genes to Cells

      巻: 25 ページ: 22~32

    • DOI

      10.1111/gtc.12732

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Structure of PCNA in complex with DNMT1 PIP box reveals the basis for the molecular mechanism of the interaction2019

    • 著者名/発表者名
      Jimenji Tomohiro、Matsumura Rumie、Kori Satomi、Arita Kyohei
    • 雑誌名

      Biochemical and Biophysical Research Communications

      巻: 516 ページ: 578~583

    • DOI

      10.1016/j.bbrc.2019.06.060

    • 査読あり
  • [学会発表] Conserved phosphorylation in UHRF1-binding partners regulates its binding to the peptide binding groove of UHRF1 TTD domain2019

    • 著者名/発表者名
      Satomi Kori, Laure Ferry, Shohei Matano, Tomohiro Jimenji, Toru Ekimoti, Takashi Oda, Pierre-Antoine Defossez, Mitsunori Ikeguchi, Kyohei Arita
    • 学会等名
      16th Conference of the Asian Crystallographic Association: AsCA2019
    • 国際学会
  • [学会発表] Structural basis for recognition of DNMT1 PIP box by PCNA2019

    • 著者名/発表者名
      Tomohiro Jimenji, Satomi Kori, Kyohei Arita
    • 学会等名
      16th Conference of the Asian Crystallographic Association: AsCA2019
    • 国際学会
  • [学会発表] A unique mechanism for multi-monoubiquitination of histone H3 by UHRF12019

    • 著者名/発表者名
      松澤舜, 若月誠, 柴野歩実, 郡聡実, 古川亜矢子, 西村善文, 西山敦哉, 中西真, 有田恭平
    • 学会等名
      第42回分子生物学会年会
  • [学会発表] Molecular mechanism for multiple-monoubiquitination of replication factor PAF152019

    • 著者名/発表者名
      柴野歩実, 松澤舜, 郡聡実, 西山敦哉, 中西真, 有田恭平
    • 学会等名
      第42回分子生物学会年会
  • [学会発表] Structural Study for Recognition of Ubiquitylated Histone H3 by DNA Methyltransferase2019

    • 著者名/発表者名
      Arita Kyohei, Ishiyama Satoshi, Nishiyama, Atsuya, Defossez, Pierre-Antoine, Nakanishi, Makoto
    • 学会等名
      ECM32 32nd European Crystallographic Meeting
    • 国際学会
  • [学会発表] Crystal structure of UHRF1:LIG1 complex revealed structural change of UHRF1 and the key residues for high affinity binding2019

    • 著者名/発表者名
      Satomi Kori, Laure Ferry, Shohei Matano, Noriyuki Kodera, Takashi Oda, Pierre-Antoine Defossez,Kyohei Arita
    • 学会等名
      ECM32 32nd European Crystallographic Meeting
    • 国際学会
  • [学会発表] Molecular mechanism for multiple-monoubiquitination of histone H32019

    • 著者名/発表者名
      松澤舜, 柴野歩実, 若月誠, 郡聡実, 有田恭平
    • 学会等名
      第13 回エピジェネティクス研究会年会
  • [学会発表] Structural basis for the regulation of DNA methylation maintenance by replication factors2019

    • 著者名/発表者名
      郡聡実, 治面地智宏, 又野翔平, 松村るみゑ, 横山遥、西山敦哉、中西真、佐藤衛, Pierre Defossez, 有田恭平
    • 学会等名
      第13 回エピジェネティクス研究会年会
  • [備考] 横浜市立大学 生命医科学研究科 構造生物学研究室 有田グループ

    • URL

      http://www-mls.tsurumi.yokohama-cu.ac.jp/xtal-mls/members/kyouhei/index.html

  • [備考] 横浜市立大学 ニュース

    • URL

      https://www.yokohama-cu.ac.jp/news/2019/202003arita.html

  • [備考] 横浜市立大学 生命医科学研究科 ニュース

    • URL

      http://www.tsurumi.yokohama-cu.ac.jp/news/20190712_arita.html

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公開日: 2021-01-27  

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