| 研究課題/領域番号 |
18H02393
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| 研究機関 | 横浜市立大学 |
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研究代表者 |
高橋 栄夫 横浜市立大学, 生命医科学研究科, 教授 (60265717)
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| 研究分担者 |
竹内 恒 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 研究チーム長 (20581284)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | NMR / 膜タンパク質 / 酵素 / 界面活性剤 / 脂質 |
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| 研究実績の概要 |
種々の異なる膜環境下における膜タンパク質の活性－構造相関についての知見を得る目的で研究を進めている。昨年度研究対象としていた好熱菌由来ロンボイドプロテアーゼの発現量が限定的であることから、今年度は大腸菌由来ロンボイドプロテアーゼGlpGも研究対象に加えた。GlpGの細胞質ドメインを除去した発現系GlpGΔCDを構築したところ、好熱菌由来のものに比べ、およそ4~10倍の発現量が得られ、NMR構造解析に供することが可能な研究対象となった。可溶性基質（BODIPY FL-casein）を用いた各種界面活性剤条件下における酵素活性を比較したところ、LDAO、DH7PCなどの界面活性剤中では低活性であるとともに、アルキル鎖の長さにより酵素活性が変化することが明らかとなった。ヘッドグループについては、特にMal系界面活性剤において高い活性が見られた。界面活性剤に可溶化したGlpGΔCDについて、選択的13Cラベル体を調製しメチル基のNMR観測することで、残基レベルでの解析を行うことが可能となった。今後、部位特異変異を活用したシグナル帰属を進めるとともに、異なる周辺環境、基質・阻害剤認識状態における解析を実施していく。
一方、好熱細菌由来光受容膜タンパク質について、NMR測定条件の最適化を行った結果、ロンボイドプロテアーゼに比較して、極めて高分解能な主鎖1H-15N NMRスペクトルが得られる条件が見出された。本膜タンパク質は、周辺環境である界面活性剤環境を変化させることで、光反応サイクルが変調されることが明らかになるとともに、NMRスペクトルにも顕著な変化が見られることが判明した。さらに、脂質二重膜環境であるバイセルに内包する試料調製法を確立することもできた。精緻なNMR構造解析を実施することを目的に、均一安定同位体ラベル試料を作製し、主鎖NMRシグナル帰属を進めようとしている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
昨年度までの研究により好熱菌由来ロンボイドプロテアーゼは、周辺環境と活性の相関について興味深い結果が得られてきたが、NMR構造解析を実施する上で、その発現量の少なさが大きな問題であった。今年度研究対象として加えた大腸菌由来ロンボイドプロテアーゼは高発現であり、周辺環境変化に依存した活性変化が見られることが明らかになるとともに、実際にNMR構造解析が実施可能であることを示すことができた。
また、光受容膜タンパク質については、これまでにNMR解析がなされてきた膜タンパク質中でも顕著に高分解能なNMRスペクトルが得られることが明らかとなり、NMRによる多様な動的構造情報が得られることが期待できる。一方で、今後、脂質二重膜環境における活性、およびNMR構造解析を進めるうえで重要となるバイセル試料調製法も確立した。
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| 今後の研究の推進方策 |
今年度、膜タンパク質を対象としたNMR構造解析が実施可能なことが示されたことから、次年度は、異なる周辺環境における動的構造情報を取得することを目標とする。そのためには先ず、NMRスペクトルの帰属が必要となるが、分子量が大きい研究対象であるため、複数の部位特異変異体の作製、アミノ酸選択ラベル体の調製などを精力的に行い、NMRシグナル帰属を推進する必要がある。
さらに、界面活性剤による疑似膜環境のみならず、脂質二重膜環境（リポソーム系、バイセル系、ナノディスク系）における活性－構造相関についての情報を得るところに重点を置いて研究を進める。
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