| 研究課題/領域番号 |
18H02412
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| 研究機関 | 佐賀大学 |
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研究代表者 |
堀谷 正樹 佐賀大学, 農学部, 助教 (80532134)
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| 研究分担者 |
渡邉 啓一 佐賀大学, 農学部, 教授 (40191754)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 生物物理 / 酵素 / 生体分子 / 電子スピン共鳴 / 構造解析 / 好冷細菌 / 低温適応 |
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| 研究実績の概要 |
南極にて生育する好冷細菌由来低温適応酵素の低温適応機構を原子レベルで解明するため、部位特異的スピンラベル法およびX線結晶構造解析法による研究を行う。低温適応酵素として、生体が糖代謝の第一段階の酵素反応として利用しているグルコキナーゼを対象とした。
部位特異的スピンラベル法はシステイン残基に特異的に結合するため、ラベル剤を付加したい箇所に変異体を導入する必要がある。ところが天然に存在するグルコキナーゼの６つのシステイン残基にもラベル剤が付着するため、まずは何か所、そしてどの部位にスピンラベル剤と反応しうるシステイン残基が存在するか検証を行った。その結果、好冷細菌由来グルコキナーゼにはひとつのシステイン残基のみしか反応しないにも関わらず、中温菌由来グルコキナーゼには３つのシステイン残基に反応することが明らかになった。さらにこの結果を発展させるべく、中温菌と低温菌で差の出た２つのシステイン残基をセリン残基に変化させた変異体を作成したところ、酵素の熱安定性と酵素活性が著しく変化することが分かった。またこのシステイン残基は古代生物のみにしか存在していないことも明らかにした。さらにスピンラベル剤での研究にむけて、部位特異的変異体のプラスミドを構築したので、今後この発現系を作成し、純粋な酵素試料を得る。
好冷細菌由来グルコキナーゼ、中温菌由来グルコキナーゼ両方において結晶構造解析、動的構造解析に向けた結晶化スクリーニングを行った。今後は現在得られている条件をさらに絞り放射光実験を行う。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
好冷細菌由来グルコキナーゼ、中温菌由来グルコキナーゼについて、それぞれ天然状態で６つ持っているシステイン残基の反応性をエルマン法により評価を行った。その結果、好冷細菌由来グルコキナーゼではひとつの、中温菌由来グルコキナーゼでは３つのシステイン残基に反応することが明らかになったので、部位特異的変異体導入法により、それぞれで数種類の変異体プラスミドを構築し、大腸菌による発現系の作成を行った。プラスミドを構築したものすべてで発現していることを確認出来た。さらに高純度の精製を行ったところ、ひとつをのぞき、全てで単一かつ構造・活性を保持した状態で高濃度試料を得ることに成功した。これらを用いたエルマン法による解析から、天然状態でのエルマン、スピンラベル剤と反応し得るシステイン残基を好冷細菌由来グルコキナーゼ、中温菌由来グルコキナーゼの双方で確定するに至った。さらにそれぞれの酵素について円偏光2色性分光法による解析、およびその温度依存性から天然状態では好冷細菌由来グルコキナーゼの方が中温菌由来グルコキナーゼより熱安定性が高いことが分かった。これは従来から通説として考えられてきた低温適応酵素の性質とは異質であることを示している。この性質を発揮している分子メカニズムを今後さらに明らかにしていく。
また低温適応機構を解明すべく、部位特異的スピンラベル法に必要な変異体のプラスミドの構築を行った。これについて発現系・精製系を確立し、低温適応機構の分子メカニズムをスピンラベル法およびX線結晶構造解析により解き明かす。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまでに天然状態好冷細菌由来グルコキナーゼ、中温菌由来グルコキナーゼにおいてスピンラベル剤と反応し得るシステイン残基を同定した。さらに低温適応機構解明に必要な個所にシステインの変異を導入したプラスミドも構築出来た。今後、これらについて発現系・精製法を確立する。得られた標本について数種類のスピンラベル剤の付加を行い、様々な個所での低温域から高温域に至る幅広い温度範囲において、構造ゆらぎがどのように変化していくか、それを好冷細菌由来グルコキナーゼ、中温菌由来グルコキナーゼにおいて比較検討を行う。
また、反応性の高いシステインを同定する際に明らかになった好冷細菌由来グルコキナーゼの熱安定性機構についても、部位特異的変異体導入法および円偏光2色性分光法より解き明かしていく予定である。
さらにX線結晶構造解析を用いて、静的な構造からも低温適応機構の分子メカニズムについて解き明かしていく予定である。
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