| 研究課題/領域番号 |
18H02423
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| 研究機関 | 基礎生物学研究所 |
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研究代表者 |
片岡 研介 基礎生物学研究所, クロマチン制御研究部門, 助教 (80784959)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | ヘテロクロマチン / HP1 / テトラヒメナ / ゲノム再編 / トランスポゾン |
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| 研究実績の概要 |
テトラヒメナの大規模ゲノム再編を誘導する高次クロマチン構造の形成機構の解明を目指して、本年度は以下の3項目の研究を実施した。
[へテロクロマチン形成に関与するHP1様タンパク質の探索] これまでの研究により、7種のHP1様タンパク質がDNA削減を誘導するヘテロクロマチンに存在し、そのうち4種は異所性DNAの削減誘導能を有していることを見出している。染色体レベルにおける各HP1様タンパク質の局在を明らかにするために、本年度は、他より入手できない4種のHP1様タンパク質に対するポリクローナル抗体の作成を試みた。うち3種の抗体を用いたテトラヒメナ抽出液に対するウエスタンブロットにおいては、予想される分子量に相当するタンパク質が検出された。また、これらの抗体を用いた固定細胞の免疫染色においては、エピトープタグを用いた場合と同様の細胞内局在が確認された。
[HP1様タンパク質間の相互依存性の解析] HP1様タンパク質間の相互の依存性を遺伝学的に検討するために、これまでに樹立されていないHP1様遺伝子の遺伝子破壊株の樹立を目指した。今年度は、3遺伝子に対するヘテロの遺伝子破壊株を樹立しており、そのうち2遺伝子に対しては、ホモの遺伝子破壊株が準備できた。
[ヘテロクロマチン内の機能性ユニットの解明] テトラヒメナのヘテロクロマチン構成タンパク質は多数見出されているが、それらの相互の関係はほとんど知られていない。各HP1様タンパク質間およびその他のヘテロクロマチン構成タンパク質間の相互作用を網羅的に解析するために、酵母ツーハイブリッド法を用いた系を準備した。本年度は、HP1様タンパク質を含む全ての既知のヘテロクロマチン構成タンパク質を発現する100種超の酵母株を用意した。また、これらの総当たり解析を簡便に行うための方法の改良も行った。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
抗体の作成に関しては、試みた4種のうち3種のHP1タンパク質に対する特異的抗体が得られており、遺伝子破壊株の樹立においては、2遺伝子において表現系を解析できる段階まで準備ができているため。酵母ツーハイブリッド法を用いた相互関係の解析に関しては、現在までに多数の組み合わせを一挙に解析するための手順を整え、必要な全ての酵母株の準備を終えているため。
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| 今後の研究の推進方策 |
特異性が確認できていない抗体に関しては、引き続き特異性の検討を行うとともに、エピトープタグを用いたクロマチン免疫沈降法を検討する。特異性が確認できた抗体に関しては、野生株、各種遺伝子破壊株においてクロマチン免疫沈降法による局在解析を進める。また、酵母ツーハイブリッド法による相互関係の網羅的解析を行う。関係がみられたタンパク質間においては、抗体を用いた免疫沈降法を用いて、テトラヒメナ細胞内における検証を進める。
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