| 研究課題/領域番号 |
18H02428
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
谷内江 望 東京大学, 先端科学技術研究センター, 准教授 (60636801)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | インタラクトーム / DNAバーコード / 次世代シークエンシング |
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| 研究実績の概要 |
がん等のヒトの疾患が単一の遺伝子や単純なパスウェイの損傷として説明できる例は少なく、その殆どは複雑な細胞内ネットワーク全体の不全 として考えなくてはならない。近年、網羅的なタンパク質間の相互作用 (インタラクトーム) が計測可能になり、医学分野においては、患者個 人のゲノム変異情報をリファレンスインタラクトームにマッピングすることで病態予測や予後予測の精度が向上することが示されている。また 疾患関連変異が他のゲノム変異に比べて有意に多くのタンパク質間相互作用を阻害することも知られている。したがって、パーソナルゲノム情 報に加えてヒト組織から固有のインタラクトームを計測することができれば、より高精度な病態予測が可能になると考えられるが、現在までに そのようなテクノロジーはない。本研究では申請者が過去に開発した高速インタラクトーム同定技術を発展させることによってパーソナルインタラクトーム技術を確立する。本年度はDNAバーコード化されたORFライブラリーを任意の検体から超並列で高速に作成する手法の開発を進め、既存のDNAバーコードコレクションを利用した安定的なORFライブラリー作成手法を樹立することに成功した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
昨年度に引き続き、DNAバーコード化されたORFライブラリーを任意の検体から超並列で高速に作成する手法の開発を進めた。本年度は、既存のDNAバーコードコレクションを利用した安定的なORFライブラリー作成手法を樹立することに成功した。本手法では、はじめに、既存のコレクション化されたBFG-Y2H法のためのDNAバーコードそれぞれをマイクロウェルプレート内でPCRによって増幅する。この際、増幅用プライマーの一方がDNAバーコードに紐づくORFの3’端とオーバラップするようにし、他方がビオチン化されたものにする。PCR反応後、増幅産物をアビジンが表面にコートされた磁気ビーズに結合させ、NaOHによって一本鎖化してビーズに結合したDNA鎖のみを得る。これが各ORFのバーコード化逆転写用プライマーとなり、任意の検体のトータルRNAからターゲットとなるORFのcDNAをバーコード化して合成することができることを確認した。その後、合成されたcDNAは混合され、一斉 にGateway BP反応によってGateway Entryベクターにクローニングできる見込みである。ここから得られるGatewayライブラリーをBFG-Y2H法によるインタラクトーム計測に用いる。昨年度までに水-油系エマルジョンを用いたバーコード化cDNA合成手法の開発を進めていたが、一旦こちらを中止して本手法を開発した。これによって、スケーラビリティーは下がるものの安定的なバーコード化ORFライブラリー作成手法を得ることができた。来年度、パーソナルインタラクトーム手法の樹立に向けて一定の成果を得られる見通しがついた。
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| 今後の研究の推進方策 |
以下の方針に沿って最終年度の研究を進める:
(1) 概念実証実験のためのORFの選定
(2) 概念実証実験のための安定的なバーコード化ORFライブラリー作成プロトコルの完成
(3) 様々なヒト培養細胞を用いたバーコード化ORFライブラリーの作成
(4) BFG-Y2H法による様々なヒト培養細胞のインタラクトーム計測からの超並列シークエンシングライブラリーの調整
(5) 超並列シークエンシングデータの解析と精度検証、培養細胞間のインタラクトームデータの比較解析
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