研究課題
生物の遺伝情報は常に損傷と修復を繰り返して変化する。多細胞生物では受精を起点に個々の細胞の増殖分化プロセスで遺伝情報は変異を蓄積して癌や老化等の原因になるものと考えられる。しかし各細胞系譜の遺伝的安定性は均一ではなく、特に生殖系列サイクルでは遺伝情報の恒常性が高いものと考えられる 。遺伝的安定性がどの様に発生プログラムと連携して機能調節を受けるのか、また何故生殖系列サイクルの遺伝的安定 性は高いのか、その制御基盤の理解は殆ど進んでいない。本研究では哺乳類の初期発生過程と生殖系列サイクルの遺伝的安定性 の発生制御メカニズムの解明を目的とし、(1)初期発生過程と生殖系列サイクルの遺伝的安定性の発生制御の全体像、(2)遺伝的 安定性の制御遺伝子群の発現調節機構、(3)遺伝的安定性の人為制御が細胞・個体に与える影響、の解明を目指す。遺伝的安定性 の発生制御は生物学上の重要課題であると共に、その制御技術は幹細胞リソースの応用等に広く重要である。本年度は、上記(1)の詳細な解析を進めると共に、(2)、(3)について実験系の立ち上げ等の準備を行った。
2: おおむね順調に進展している
生殖系列サイクルを中心とする遺伝情報制御の全体的な特性をより体系的に理解する事を目的に、多能性幹細胞株、生殖幹細胞株、体細胞株等のモデル細胞を用いて遺伝的安定性に関わる様々な指標の包括的な解析に取り組んだ結果、生殖幹細胞株は、多能性幹細胞株や体細胞と比べて、遺伝的安定性の幾つかの指標が明瞭に高い事、生殖幹細胞株と多能性幹細胞株は遺伝的安定性に関わる機能遺伝子群の特徴的な発現相違を示す事、等を示す結果を得た。これら観察に関わる遺伝子/経路の機能を明らかにする為に、レンチウイルスベクターを介して転写活性化型dCas9遺伝子をマウスES細胞に組み込んだ後に、解析対象とする遺伝子（本年度はチェックポイントキナーゼ等）のプロモーター配列をターゲットとする複数のgRNA発現レンチウイルスを導入した。qRT-PCRにより目的遺伝子の発現上昇を比較解析し、ゲノムに組み込まれたレンチウイルス/トランスジーンのコピー数の検定を行った。更に目的遺伝子の発現上昇が明瞭に観察されたマウスES細胞株（プール）について、染色体分配の安定性等の指標を詳細に調べた。またヒトiPS細胞についても同様の実験系の作出を進めた。
生殖系列サイクルの遺伝的安定性の制御遺伝子群のマルチオミクス解析: 多能性幹細胞、生殖幹細胞、体細胞の各細胞系譜の発生段階による遺伝的安定性の相違は、その制御遺伝子群（DNA修復、DNA複製、染色体制御、細胞周期制御、抗酸化制御など）の遺伝子発現調節や機能調節に基づくものと考えられ、その実体にアプローチするためにマルチオミクス解析を行う。マウス多能性幹細胞、生殖幹細胞、繊維芽細胞のRNAseq発現データは既に得ており、各分化誘導モデルのデータを追加すると共に、public domainのデータセットを利用する。ゲノム損傷応答では修復蛋白質の安定性や翻訳制御が大きな役割を担う事から、包括的プロテオーム解析を行う。遺伝的安定性の制御遺伝子群の発現調節機構の解明: 多能性幹細胞と生殖幹細胞ではそれぞれ遺伝的安定性の制御に関わる特定の遺伝子サブセットが協調して発現制御される。これら遺伝子発現制御の相違のメカニズムを明らかにする為にゲノムワイドスクリーニングを行う。Loss of functionスクリーニングは、マウスのほぼ全遺伝子のエクソン領域をターゲットとするゲノムワイドgRNAプールとCRISPR/Cas9システム、およびgain of functionスクリーニングはマウスのほぼ全遺伝子のプロモーター領域をターゲットとするgRNAプールとDNA切断活性を持たずに転写活性化能を持つ変異型CRISPR/Cas9システムを用いる。機能候補遺伝子はcDNA過剰発現、ノックアウト実験等を行い、遺伝的安定性の制御遺伝子群の発現調節機構を解明する。
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EMBO Rep
巻: 19 ページ: e42054
10.15252/embr.201642054
