| 研究課題/領域番号 |
18H02436
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
吉村 成弘 京都大学, 生命科学研究科, 准教授 (90346106)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | エンドサイトーシス / クラスリン / ダイナミン / アクチン / ライブセルイメージング / 原子間力顕微鏡 / BARドメインタンパク質 |
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| 研究実績の概要 |
Ⅰ：クラスリン依存的エンドサイトーシスにおける細胞膜と細胞骨格の動的協奏関係の解明
昨年度に引き続き、2秒の高時間分解能高速AFMイメージングをおこない、クラスリン依存的エンドサイトーシスの閉口過程の詳細なメカニズムの解明に取り組んだ。特に、ピット閉口時に見られるi)非対称な膜の隆起、ii)小開口、iii)完全な閉口、の3つの過程に着目し、関与するタンパク質の解明を目指した。アクチン阻害剤を用いた実験により、膜の隆起がアクチン重合により引き起こされること、膜の隆起により小開口へと至ることが多いが、隆起が生じない場合でも小開口に至る経路が存在することが明らかになった。また、膜曲率を変化させることが知られているBARドメインを含むタンパク質(CIP4, Syndapin2, FBP17, Toca1)をRNA干渉によりノックダウンし、同様の解析をおこなった結果、Syndapin2とFBP17の両方をノックダウンしたときに、アクチン阻害時と同様の効果が見られた。これらの結果と過去に報告された知見とを総合すると、これらのBARドメインタンパク質がピット近傍にアクチンを誘導していることが考えられる。非対称なアクチンの集積による膜形態変化に関しては、昨年度に引き続き、Padmini博士が構築したSnap Throughモデルを用いて力学的解析をおこなっている。
Ⅱ：各種エンドサイトーシス経路による細胞膜張力調節機構の解明
ポリジメチルシロキサン製ストレッチチャンバを高速AFMシステムに組み込み、伸長もしくは弛緩直後の細胞表層の構造変化を観察する技術を確立した。伸展刺激を加えた場合、クラスリンピットの開口頻度の減少が見られるとともに、閉口過程で小開口の時間の延長が見られた。これらの結果は、開口過程と小開口から閉口へと至る過程に張力依存的機構が存在することを示す重要なものである。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度の計画は概ね順調に進展している。特に、高速原子間力顕微鏡の時間分解能の向上により、クラスリン依存的エンドサイトーシスの閉口過程に見られる特徴的な膜構造を可視化・同定し、その分子機構解明の足がかりとなるタンパク質を同定できたことは非常に大きな進歩である。一方で、単一タンパク質の阻害やノックダウンでは、エンドサイトーシスの進行を完全に抑えることができないという結果は、閉口過程には複数の経路（機構）が存在することを示唆し、さらに詳細な実験系もしくは解析系構築の必要性を示すものである。膜モデルに関しては、昨年度まで用いた2Dモデルでの解析を進めるとともに、膜の非対称性をより詳細に解析するための3Dモデルの構築も同時に進めている。研究項目Ⅱに関しては、計画通り、超薄型ストレッチチャンバを高速AFMに組み込むことに成功し、クラスリン依存的エンドサイトーシス各ステップの膜張力依存性を解析する実験系を構築した。すでに張力依存的過程を同定することに成功しており、今後、膜モデルとの統合による詳細な解析をおこなう予定である。また、クラスリン依存的経路以外の経路の解析にも着手している。マドリード大学のM.A. del Pozo教授と共同研究で、膜張力との関係性がこれまでに報告されているカベオラの動態を観察・解析する系を構築しつつある。
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| 今後の研究の推進方策 |
項目Ⅰに関しては、これまで確立した高時間分解能イメージングを継続し、閉口過程の分子機構を、アクチン、BARドメインタンパク質、ダイナミンなどのタンパク質に着目し、解析を進める。さらに、得られた結果を説明しうる2Dおよび3Dモデルを構築することで、タンパク質による膜変形の分子メカニズムの解明を目指す。この計画は、引き続きカリフォルニア州サンディエゴ校のPadmini博士との共同研究で進める予定である。クラスリン依存的経路以外の経路に関しては、カベオラを中心に解析を進める。これまでに、蛍光タンパク質を融合させたカベオリン1および2をCOS7細胞に発現させ、共焦点蛍光顕微鏡と高速AFMの相関イメージングを確立している。今後はこの系を用いて、膜張力とカベオラの構造との関係性を、ストレッチチャンバ等を用いて解明する。この系は、マドリード大学のdel Pozo博士との共同研究で進める予定である。
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