| 研究課題/領域番号 |
18H02477
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
小野 大輔 名古屋大学, 環境医学研究所, 助教 (30634224)
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| 研究分担者 |
徳田 功 立命館大学, 理工学部, 教授 (00261389)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 概日リズム / 睡眠 / 光イメージング |
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| 研究実績の概要 |
概日時計中枢である視交叉上核からの出力経路を同定するため、視交叉上核特異的に蛍光タンパク質であるhrGFPを発現させ、軸索が密にみられる領域を確認した。Gad67-CreマウスにAAVを用い、CMV-flex-hrGFPを発現させた。３週間後に還流固定を行い脳を取り出し、クライオスタットにて脳切片を作成し、蛍光顕微鏡を用いて観察を行った。その結果複数の領域に軸索が確認された。その中から室傍核に着目した。室傍核には様々な神経細胞がみられるが、その中でもストレス応答に関わるCRF神経に着目した。次にCRF-Creマウスの室傍核にAAVを用いて、ChR2-EYFPを発現させ、脳波・筋電図計測用の電極およびプローブを装着させた。同時に光ファイバーを室傍核直上に挿入した。手術後２週間の回復期間を得たのち、睡眠計測を行うと同時に10Hzでの光照射を行った。その結果、室傍核CRF神経の光照射により、覚醒の割合が増加した。この結果は、室傍核CRF神経は覚醒に関わる神経細胞群の一つと言える。
発光を用いた光イメージングツールの開発も進めた。沖縄産発光タンパク質を用い、スプリット型カルシウムプローブを開発した。これをHEK細胞に発現させ、カルバコールの投与により発光輝度が変化する事を確認した。また光遺伝学ツールとの併用も可能である事を確認した。さらにcAMPを計測できるスプリット型発光プローブの作成も行い、HEK細胞に発現させ、フォルスコリン投与により発光輝度が上昇する事を確認した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
概日時計からの出力経路の一つを同定できている点、発光を用いたイメージングが出来ている点、さらに視交叉上核への入力の可能性を示すデータが得られている点で計画以上の進展があると言ってよい。
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| 今後の研究の推進方策 |
室傍核CRF神経の下流領域を同定する。軸索終末の脳領域を確認すると同時に、光ファイバーを挿入し光照射で覚醒が誘導される領域を同定する。電気生理学的に特定の細胞への入力を確認する。逆行性の神経トレーシング技術を導入する。ファイバーフォトメトリーを用いて特定細胞の細胞活動を計測する。
発光プローブ開発に関しては、BRETを用いてより高輝度プローブを開発する。人工基質を用いさらに長波長にシフトするツールを開発する。
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