| 研究課題/領域番号 |
18H02485
|
|---|
| 研究機関 | 国立遺伝学研究所 |
|---|
研究代表者 |
仁木 宏典 国立遺伝学研究所, 遺伝形質研究系, 教授 (70208122)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2022-03-31
|
| キーワード | 核様体 / ゲルシフトアッセイ方法 / 一本鎖DNA / DNA結合 / アミノ酸残基置換 |
|---|
| 研究実績の概要 |
コンデンシン複合体はリング構造を取り、その内部にDNAを取り込む、いわゆるトポロジカルDNA結合をする。バクテリアコンデンシン複合体は一本鎖DNA(ssDNA)特異的にトポロジカルDNA結合する。その結合のメカニズムのうち、1)なぜssDNAを特異的に認識し(ssDNA認識)、2)どのようにしてDNA挟みこみ(トポロジカル結合能)、3) トポロジカル結合後にどのようにしてDNA凝縮させるのか(凝集活性)、以上3点の分子特性を大腸菌のコンデンシンであるMukBの精製タンパク質を使った生化学実験で調べた。DNAが結合するMukBヘッドドメインうち塩基性アミノ酸について、置換変異体を作成し、これら変異による大腸菌の生育や核様体分配にへの影響を調べ、いくつかの変異で生育阻害や分配異常を見出した。また、これら変異MukBの大量発現系とその精製系を確立し、精製した変異MukBタンパク質の一本鎖DNAと二本鎖DNAへの結合能力を定量的に測定した。測定にはゲルシフトアッセイ方法を採用し、結合能力は基質となるDNAの半分量をシフトさせるのに必要なMukBタンパク質の量で現した。この結果、二本鎖DNAに比べて、一本鎖DNAに対して著しく結合能力が低下するアミノ酸残基を特定することができた。他方、枯草菌のrDNA遺伝子領域へのバクテリアコンデンシンの細胞内でのローディング機構を明らかにするため、Sodium Bisulfate処理による一本鎖の検出を進め、rDNA遺伝子領域内での一本鎖DNA領域を再現性よく、また定量的に検出することができるようになった。その結果、細胞内で特異的に一本鎖DNAを作り出す領域をrDNA遺伝子領域内に確認することができた。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
提案した計画の作業仮説を基に研究を進めており、これまでの実験からその仮説のとおりに二本鎖DNAに比べて、一本鎖DNAに対して著しく結合能力が低下するアミノ酸残基を特定することができた。また、これらの残基の変異体では、大腸菌の生育にも影響がでており、バクテリアコンデンシンの機能の解明が徐々に進んでいる。
|
| 今後の研究の推進方策 |
精製タンパク質を使い、二本鎖DNAに比べて、一本鎖DNAに対して著しく結合能力が低下するアミノ酸残基を特定することが可能となったが、変異体によってはまだ精製できる量が十分ではないため、最終的なサンプルのタンパク質濃度が低い。これらを改良するなど、精製タンパク質の活性の安定化を図り、実験の再現性を向上させる。
|
