ゲノム情報を用いたハブ毒タンパク質の包括的多様性および進化過程の解明

2018 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 18H02498
• 研究機関: 九州大学
• 研究代表者: 柴田 弘紀 九州大学, 生体防御医学研究所, 准教授 (80315093)
• 研究分担者: 小川 智久 東北大学, 生命科学研究科, 准教授 (80240901)
• 研究期間 (年度): 2018-04-01 – 2022-03-31
• キーワード: 遺伝的多様性 / ハブ / 毒液タンパク質 / 加速進化 / 系統地理学

研究実績の概要

本研究計画では、日本産ハブ属3種の毒液タンパク質遺伝子の塩基配列多様性の大規模検出（計画1）と毒液タンパク質のオミクス解析（計画2）を行い、ハブの毒液タンパク質の多様性とその進化過程の解明を解明することを目的としている。
計画1については、本年度は、毒液タンパク質セット50遺伝子と非毒型パラログ12個についてアンプリコンシークエンスのためのプライマー設計を行った。対象とする毒液遺伝子セットには、多数コピーからなる遺伝子族を構成しているものがあり、PCR条件の最適化がやや難航している。それに並行して、毒液タンパク質遺伝子セットとの比較対象としてミトコンドリアDNAの配列決定とデータ収集を進めた。先行研究（2013-15年度基盤C）で、多型性の特に高い領域として選定済みの5kbを対象に、ダイレクトシークエンスにより10島からの計101個体についての変異情報を取得した。
計画2については、本年度は、研究協力者（寺田考記（沖縄衛生環境研））の協力のもと、トカラ列島の宝島および小宝島での採集を行い、それぞれ予定のサンプル数を収集することができた。研究協力者から提供を受けた個体を合わせて、合計8島からの計30個体から、筋肉組織、毒腺、毒液を採取を完了した。それぞれDNA／RNA抽出および研究分担者（東北大学・小川智久）によるプロテオーム解析を進めている。一方、久米島と伊平屋島での同様の採集を予定していたが、研究協力者の都合がつかず、年度内に行うことができなかった。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

毒液遺伝子は複数のコピーからなる遺伝子族を構成しており、PCR条件の最適化が困難な場合があるため、計画1のためのアンプリコン設計が遅れている。
研究協力者（寺田考記（沖縄衛生環境研））の所属機関の移転により、当初予定していた現地調査と採集が遂行できなかったため、計画2のためのサンプル収集がやや遅れている。

今後の研究の推進方策

1. [検体整備]：事情により本年度に収集ができなかった2島を含む、伊平屋島、渡嘉敷島、久米島での採集を、研究協力者（寺田考記（沖縄衛生環境研））の協力のもと遂行し、計画2のための検体収集を完了する。計画1のための検体収集はひきつづき進めていく。
2. [毒液タンパク質遺伝子セットの解析]：アンプリコンシークエンスのためのプライマー設計とPCR条件の最適化を引き続き進める。今後も困難が予想される際には、一部については通常のPCRによるダイレクトシークエンスに切り替えて、データ取得を進める。
3. [毒腺のトランスクリプトーム解析]：取得済みの毒腺からのRNA抽出とRNAシークエンスを進める。当初は研究代表者の所属機関に導入済みのHiSeq2500でデータ取得を行う予定であったが、NGSのアウトソーシングの価格が非常に下がってきたので、適宜利用してコストダウンを図る。
4. [毒液のプロテオーム解析]：研究分担者の小川智久（東北大学）の協力のもと、取得済みの毒液からのフォーカスドプロテオーム解析を進める。

研究成果

• [雑誌論文] The habu genome reveals an evolutionary background of venom protein genes. (2018)
  • 著者名/発表者名: Shibata H, Chijiwa T, Oda-Ueda N, Nakamura H, Yamaguchi K, Hattori S, Matsubara K, Matsuda Y, Yamashita A, Isomoto A, Mori K, Tashiro K, Kuhara S, Yamasaki S, Fujie M, Goto H, Koyanagi R, Takeuchi T, Fukumaki Y, Ohno M, Shoguchi E, Hisata K, Satoh N, Ogawa T.
  • 雑誌名: Sci Rep. 巻: 8 ページ: 11300
  • DOI: 10.1038/s41598-018-28749-4
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] An albino mutant of the Japanese rat snake (Elaphe climacophora) carries a nonsense mutation in the tyrosinase gene. (2018)
  • 著者名/発表者名: Iwanishi S, Zaitsu S, Shibata H, Nitasaka E.
  • 雑誌名: Genes Genet Syst. 巻: 93 ページ: 163-167
  • DOI: 10.1266/ggs.18-00021
  • 査読あり
• [学会発表] Whole genome sequencing of a Japanese endemic pit viper, habu, Protobothrops flavoviridis reveals accelerated evolution of venom protein genes enriched in microchromosomal regions. (2018)
  • 著者名/発表者名: Shibata H, Chijiwa T, Oda-Ueda N, Yamaguchi K, Hattori S, Matsubara K, Matsuda Y, Isomoto A, Koyanagi R, Hisata K, Fukumaki Y, Ohno M, Shoguchi E, Satoh N, Ogawa
  • 学会等名: The International Society of Toxinology 2018 European Section Congress, Yerevan, Armenia.
  • 国際学会
• [学会発表] ホンハブのSmall Serum Protein (SSP)遺伝子アレイの特異な構造と進化 (2018)
  • 著者名/発表者名: 稲丸賢人、千々岩崇仁、竹内亜美、前田真理恵、山口和晃、柴田弘紀、服部正策、上田直子、大野素徳
  • 学会等名: 第41回日本分子生物学会年会、パシフィコ横浜
• [学会発表] Whole genome sequencing of a Japanese endemic pit viper, habu, Protobothrops flavoviridis reveals accelerated evolution of venom protein genes enriched in microchromosomal regions. (2018)
  • 著者名/発表者名: Shibata H, Chijiwa T, Oda-Ueda N, Yamaguchi K, Hattori S, Matsubara K, Matsuda Y, Koyanagi R, Hisata K, Fukumaki Y, Ohno M, Shoguchi E, Satoh N, Ogawa T.
  • 学会等名: SMBE 2018, Yokohama, Japan
  • 国際学会
• [学会発表] ハブ（Protobothrops flavoviridis）の全ゲノム配列決定から明らかになった毒液関連遺伝子群の多重化および加速進化と染色体構造との関係 (2018)
  • 著者名/発表者名: 柴田弘紀、千々岩崇仁、小田-上田直子、服部正策、松原和純、松田洋一、山崎慎一、藤江学、後藤大輝、小柳亮、竹内猛、服巻保幸、大野素徳、将口栄一、久田香奈子、佐藤矩行、小川智久
  • 学会等名: 日本爬虫両棲類学会第57回大会、麻布大学、相模原
• [図書] Biomineralization: From Molecular and Nano-structural Analyses to Environmental Science. (2018)
  • 著者名/発表者名: Ogawa T, Sekikawa A, Sato H, Muramoto K, Shibata H, Hattori S.
  • 総ページ数: 413
  • 出版者: Springer Nature, Singapore
  • ISBN: 978-9811310010