| 研究課題/領域番号 |
18H02561
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
松崎 勝巳 京都大学, 薬学研究科, 教授 (00201773)
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| 研究分担者 |
矢野 義明 京都大学, 薬学研究科, 講師 (60402799)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 蛍光イメージング |
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| 研究実績の概要 |
Gタンパク質共役型受容体（GPCR）の多量体形成を生細胞膜で正確に測定するための新規タグ－プローブラベル法の開発を引き続き行った。
従来のコイルドコイルラベル法であるE3-K4ペアと交差性のあるペア候補である、アスパラギン残基を１つ導入した配列ペアEN3.5-2aタグとKN3.5-2aプローブについて、タグ付加したbeta2アドレナリン受容体を一過性発現したCHO-K1細胞に対し蛍光色素Alexa568で標識したプローブを添加する実験により、解離定数Kdが48.7 ± 16.7 nMであると求められた。しかし、測定を行う中で、タグ付加膜タンパク質の膜表面への発現が芳しくなく、蛍光強度を測定しにくいという問題が生じたため、タグ付加膜タンパク質の膜表面への発現性の改善に取り組むことにした。
タグ付加膜タンパク質の膜表面への発現を向上させるため、膜タンパク質の膜表面への発現を向上させるとされているシグナルペプチドr-spに着目し、それをEN3.5タグのN末端側に付加したr-sp-EN3.5タグ(r-sp-EN3.5-β2AR-EYFP)を作製した。目的通りシグナルペプチドを付加することにより、タグ付加膜タンパク質の膜表面への発現性を向上させることに成功した。
また、より会合力の強いペアとして、アスパラギン残基を２つ 導入したEN24タグ-KN24プローブをデザインし、蛍光標識プローブ合成とタグ付加受容体作成を行った。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
従来のペアと交差性がある配列候補をこれまでに見出し、今後会合力の向上も可能であると考えられる。ヘテロ会合体検出用の遺伝子組替え、発現にも大きな問題はないと予想される。
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| 今後の研究の推進方策 |
EN3.5タグ-KN3.5プローブの配列を長くした、EN24タグ-KN24プローブによる標識を検討する。解離定数を正確に測定するために、EN24タグ付加アドレナリン受容体安定発現細胞を用いた標識を行う。
ラベル法が確立できれば、ヘテロ会合するスタンダードであるclass C GPCRのGABAB1/GABAB2へテロ会合体を測定し、解析法を確立するとともに、子癇前症への関与が示唆されているアンジオテンシンⅡⅠ型受容体とブラジキニンB2受容体、アンジオテンシンⅡの繊維形成への関与が示唆されているアンジオテンシンⅡⅠ型受容体とＩ型カンナビノイド受容体等のGPCRヘテロオリゴマーの会合状態測定を行う。
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