| 研究課題/領域番号 |
18H02563
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| 研究機関 | 横浜市立大学 |
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研究代表者 |
川崎 ナナ 横浜市立大学, 生命医科学研究科, 教授 (20186167)
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| 研究分担者 |
太田 悠葵 横浜市立大学, 生命医科学研究科, 特任助教 (10583453)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | iPS細胞 / 再生治療 / 糖鎖 / 分化マーカー / 質量分析 |
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| 研究実績の概要 |
本研究の目的は、iPS細胞由来神経細胞や心筋細胞に特徴的な糖タンパク質を見出し、分化評価法を開発することである。
iPS細胞研究の進展に伴い、iPS創薬や再生医療実現への期待が高まっている。iPS創薬の実用化と再生医療の有効性・安全性確保には、iPS細胞由来臓器細胞の品質評価・管理法の開発は必須である。現在のところ、臓器に分化した細胞の評価には、分化後の機能から予想される核内分子などが用いられているが、特異性・定量性・応用性などに課題がある。すなわち、評価マーカーの種類が限られており、細胞の多様性を十分評価できていない可能性が否定できないこと、細胞の固定化が必要であり、定量性に問題があること、細胞の選別に利用できないことなどである。細胞表面には多数の糖タンパク質が存在し、糖鎖は分化、成熟、がん悪性化に伴い変化することが知られている。分化細胞に特異的な細胞表面糖鎖を複数同定し、分化評価マーカーとして利用できれば、これらの問題を解決できる。本研究では、LC/MS/MSを用いたグライコプロテオミクス技術により、iPS細胞から神経・心筋細胞に分化する過程の細胞膜糖タンパク質を時系列的・体系的・網羅的に解析し、機能解析やパスウェイ解析と組み合わせ、分化関連糖タンパク質を見つけ出す。
2018年度は、iPS細胞を神経幹細胞、神経前駆細胞、ドパミン作動性神経様細胞に分化させ、グライコプロテオミクスを行うための各種分析条件の検討を行った。その結果、細胞溶解液から効率的に糖ペプチドを濃縮するための条件を設定することができた。また、糖ペプチド解析のためのプログラム作成に着手した。予備的結果ではあるが、神経分化に伴って、接着関連タンパク質の糖鎖が変化する傾向が認められた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
まず、iPS細胞を神経幹細胞、神経前駆細胞、ドパミン作動性神経様細胞に分化させ、免疫学的評価により、目的とした細胞に分化していることが示唆された。さらに、各細胞から膜タンパク質を抽出し、還元アルキル化とトリプシン消化を行い、LC/MS/MSによるタンパク質の網羅的解析を行い、同定されたタンパク質群から、意図した細胞に分化していることを確認した。
つぎに、グライコプロテオミクスのための試料調製の最適化を行った。iPS細胞、神経幹細胞、神経前駆細胞、ドパミン様細胞の膜フラクションを還元アルキル化し、トリプシンで消化した。このままLC/MS/MSを行うと、共存するペプチドによるイオン化抑制が生じ、糖ペプチドのMSデータを取得すること困難であることから、糖ペプチドを濃縮する必要がある。我々はすでに、N-結合型糖鎖修飾ペプチド濃縮のための固相抽出用チップを開発しているが、タンパク質量が豊富な細胞抽出液への対応は難しいことから、バッチ法による濃縮を検討した。複数のモデル糖タンパク質を用いて検討し、N-結合型糖鎖修飾ペプチドを高効率で濃縮できる方法を見出した。
濃縮した糖ペプチドをnano-ESI-LC/MS/MSにより解析した。まだ予備的段階ではあるが、網羅的な解析結果を統計的に処理し、GO解析やパスウェイ解析を実施したところ、複数の接着関連タンパク質の糖鎖が変化していることが示唆された。実際、マススペクトルを確認したところ、インテグリン類の糖鎖が変化していることが確認された。また、次年度に向けて、O結合型糖鎖修飾ペプチドの濃縮法の開発に着手した。
以上のように、N-結合型糖鎖だけでなく、O-結合型糖鎖修飾タンパク質の解析にも着手していることから、当初の計画以上に進展しているといえる。
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| 今後の研究の推進方策 |
2019年度はまず、分化関連N-結合型糖鎖修飾タンパク質の詳細解析を目的として、前年度とは異なる種類のiPS 細胞株（7種以上）を用いて、神経細胞や心筋細胞への分化条件を検討する。免疫学的評価やプロテオミクスにより、適切に分化したと判断される細胞株を選び、グライコプロテオミクスのための細胞数を確保する。
前年度最適化した方法を用いて、前年度とは異なるiPS細胞に由来する神経分化細胞、及び心筋細胞のグライコプロテオミクスを行い、分化ステージに特徴的な糖鎖の変化を見出す。前年度の結果と合わせて、分化評価マーカーとしての妥当性を総合的に評価する。
つぎに、O-GlcNAc修飾タンパク質の網羅的解析に向けて、細胞全タンパク質を回収する方法を検討する。トリプシン消化の最適化を行い、O-結合型糖鎖修飾ペプチド、O-GlcNAc化ペプチドに加え、O-GlcNAc化と競合するといわれているリン酸化ペプチドを濃縮する方法を検討する。
LC/MS/MS によるO-結合型糖鎖修飾ペプチド、O-GlcNAc化ペプチド、及びリン酸化ペプチドの網羅的解析を行い、分化ステージごとに特徴的なO-結合型糖鎖修飾、O-GlcNAc化、およびリン酸化を明らかにする。またGO解析やKEGG パスウェイ解析を行い、神経や心筋分化に関係のある修飾を絞り込む。
2020年度は絞り込んだ糖鎖修飾を用いて、分化評価方法を開発する。
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