| 研究課題/領域番号 |
18H02577
|
|---|
| 研究機関 | 信州大学 |
|---|
研究代表者 |
中村 昭則 信州大学, 医学部, 特任教授 (10303471)
|
|---|
| 研究分担者 |
宮崎 大吾 信州大学, 医学部附属病院, 講師(特定雇用) (80596370)
柴 直子 信州大学, 医学部, 助教(特定雇用) (00639289)
柴 祐司 信州大学, 学術研究院医学系, 教授 (70613503)
青木 吉嗣 国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター, 神経研究所 遺伝子疾患治療研究部, 室長 (80534172)
武田 伸一 国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター, その他部局等, 部長 (90171644)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
|
| キーワード | Duchenne型筋ジストロフィー / DMD遺伝子 / エクソン・スキップ治療 / アンチセンス核酸 / ゲノム編集 / iPS細胞 |
|---|
| 研究実績の概要 |
Duchenne型筋ジストロフィー（DMD）は、DMD遺伝子変異によりジストロフィンが欠損するために全身の骨格筋・心筋の変性・壊死が起こり、呼吸不全や心不全で死亡する重篤な筋疾患である。現在のところ根本的治療は開発されていないが、アンチセンスオリゴヌクレオチド（核酸医薬品）によりアミノ酸の読み取り枠を修正するエクソン・スキップ治療の臨床応用が進んでいる。最近、我々はエクソン3－9欠失を有したBecker型筋ジストロフィー（BMD）患者の骨格筋症状が極めて軽微であることを報告した。DMD遺伝子変異の約10％がエクソン3～7の領域に集積しているため、この領域に変異を有するDMD患者に対しエクソン3－9スキップ治療を行うことができれば、極めて有望な治療法になり得ると考えた。本研究では、エクソン4－7欠失を有するDMD患者の末梢血リンパ球からiPS細胞を樹立し、そのiPS細胞から分化誘導した骨格筋と心筋細胞に対してアンチセンス核酸（モルフォリノ）およびCRISPER/Cas9によるゲノム編集の両手法によって、エクソン3－9欠失型に変換する治療の基盤研究を行うことを目的としている。
これまでに、DMD遺伝子エクソン4－7欠失を有するDMD患者、エクソン3－9欠失を有するBMD患者、および健常者から末梢血リンパ球を採取・分離し、OCT3/4、SOX2、KLF4、L-Myc遺伝子の導入を行ってiPS細胞の樹立、および骨格筋・心筋細胞への分化誘導を検討してきた。しかしながら、マイクロアレイなどの遺伝子発現解析の結果から各細胞の遺伝学的バックグラウンドが異なることで、治療効果や解析結果に大きな影響を与える可能性があることが判明した。そこで、正常者の末梢リンパ球から誘導したiPS細胞に対してゲノム編集によりエクソン4－7欠失iPS細胞、エクソン3－9欠失iPS細胞を作製を試みている。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
計画通り、DMD遺伝子エクソン4－7欠失を有するDMD患者、エクソン3－9欠失を有するBMD患者、および健常者から末梢血リンパ球を採取・分離し、OCT3/4、SOX2、KLF4、L-Myc遺伝子を導入することでiPS細胞の樹立と心筋細胞などへの分化誘導を検討してきた。しかしながら、マイクロアレイなどの解析から提供元の遺伝学的バックグラウンドなどが異なることから、治療効果や解析結果に大きな影響出てしまう可能性があることが分かってきた。そこで、現在、正常者の末梢リンパ球から誘導したiPS細胞に対してゲノム編集によりエクソン4－7欠失iPS細胞、エクソン3－9欠失iPS細胞の作製して、その細胞に対してアンチセンス核酸およびゲノム編集による治療実験を行う方針としている。
|
| 今後の研究の推進方策 |
本年度の計画として、
１）正常iPS細胞、ゲノム編集により作製したエクソン4－7欠失iPS細胞およびエクソン3－9欠失iPS細胞に対して、MyoD導入により骨格筋細胞へ、CHIR、Activin A、MG、BMP4、Xavを導入により心筋細胞への分化誘導を行い、ジストロフィンの発現の有無の確認とマイクロアレイによる遺伝子の網羅的発現解析を行う。
２）エクソン4－7欠失iPS細胞より分化誘導した心筋、骨格筋細胞に対して、アンチセンス核酸モルフォリノによるエクソン3、8、9スキップを行い、ジストロフィンタンパク質の発現回復および治療前後におけるジストロフィン関連タンパク質の発現を検討する。治療前後の各細胞についてマイクロアレイを用いた遺伝子網羅的発現解析を行い、発現に有意差のある分子については定量的PCRおよびウエスタンブロットで確認をする。細胞機能についてカルシムイメージングによるカルシウム動態の検討を行う。
３）エクソン4－7欠失iPS細胞に対しては、新たに設計したguide RNAとCRISPR/Cas9コンポーネントを発現ベクターで導入し、エクソン3、8、9 をスキップするようにゲノム編集を行う。ゲノム編集を受けたiPS細胞を心筋、骨格筋に分化誘導し、ジストロフィンタンパク質の発現回復および治療前後におけるジストロフィン関連タンパク質の発現を検討する。治療前後の各細胞についてマイクロアレイを用いた遺伝子網羅的発現解析を行い、発現に有意差のある分子については定量的PCRおよびウエスタンブロットで確認する。細胞機能についてカルシムイメージングによるカルシウム動態の検討を行う。
４）エクソン3－9スキップ治療におけるアンチセンス核酸モルフォリノとゲノム編集の治療効果等について比較検討を行う。
|
