| 研究課題/領域番号 |
18H02580
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| 研究機関 | 横浜市立大学 |
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研究代表者 |
五嶋 良郎 横浜市立大学, 医学研究科, 教授 (00153750)
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| 研究分担者 |
増川 太輝 横浜市立大学, 医学部, 助教 (10711898)
小池 正人 順天堂大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (80347210)
新井 信隆 公益財団法人東京都医学総合研究所, 病院等連携研究センター, 参事研究員 (10167984)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | L-ドーパ / 受容体 / GPR143 / トランスポーター / ドパミン作動性神経伝達 |
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| 研究実績の概要 |
課題 Ⅰ) ドーパ含有小胞の証明：初年度は、市販の特異的抗ドーパ抗体を用いて、ドーパ陽性シグナルを光学顕微鏡レベルで観察・確認したのち、超薄切片を作成し、免疫電験において、ドーパ陽性シグナルを内包する小胞構造の有無を検索することを試みた。同抗体を用い、光学顕微鏡レベルにおいて、ドーパ合成酵素チロシン水酸化酵素（TH, tyrosine hydroxylase）の局在とほぼ一致するシグナルを検出することに成功した。本抗体を用いて、比較的高いレベルのドーパシグナルが見出された小脳において、金コロイド粒子を用いた免疫電顕解析を行ったが、組織内において特定の小胞構造内に局在する分布は認められなかった。このため、より高親和性の特異的ドーパ抗体の作製を試みることとなった。また、小胞トランスポーター候補分子としてvGlut2やその他のSLC (solute carrier family)分子群の神経細胞における局在・発現パターンを解析した。一方、複合体分子を形成した細胞膜ドーパトランスポーター活性を獲得するrBAT (SLC3A1) /BAT1(SLC7A9) の各々の分子が、特定の神経・非神経細胞に共局在することを見出しつつある。
課題 Ⅱ) PDモデルにおけるGPR143の役割の解明：GPR143がPDのα-シヌクレインと共局在することを見出した。本年度は、GPR143が、PDの病態とどのような関係性を有するかを検討するため、PDモデル動物において、野生型とGPR143遺伝子欠損マウスとの間でドパミン神経変性の程度を比較・解析を開始した。
課題 Ⅲ) GPR143の情報伝達機構：GPR143とアドレナリンα1受容体との機能的連関を見出した。他のGタンパク質連関型受容体 (GPCRs) についても、同様な機能的連関が存在するか否か、またこの機能的連関が、これらのGPCRsを介する各々のシグナル伝達に対して、どのような影響を及ぼすか、について解析を開始した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ドーパについてのトランスポーター分子の同定は、そのためのツール開発を行ってきた。今回、新たに特異的抗ドーパ抗体を獲得することができた。これを用いて、ドーパ含有小胞の形態学的解析を行う準備が整った。一方、GPR143が他のGタンパク質連関型受容体(GPCR)と相互作用し、様々なシグナル伝達の制御を行っていることを示唆する知見が集積しつつある。全体として、概ね順調に進展しているといえる。
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| 今後の研究の推進方策 |
課題 I) ドーパ含有小胞の証明：昨年度の取り組みによって獲得された特異的抗ドーパ抗体を用い、まずは光学顕微鏡レベルにおいて、ドーパシグナル陽性シグナルが、TH阻害によるドーパ合成阻害により減少をするか否かを検討する。陽性シグナルの減少を確認できた場合、線条体、黒質、孤束核において、免疫電験による解析を行う。また、rBAT (SLC3A1) およびBAT1(SLC7A9) を、線条体あるいは孤束核局所においてshRNAによりノックダウンした際、当該部位における微量透析法によって検出されるドパミン、ドーパの量的変動を、ノックダウン前後で比較する。
課題 Ⅱ) PDモデルにおけるGPR143の役割の解明：本年度は、GPR143が、MPTPによる神経変性のどのプロセスに関与するのかを解析する。すでに、GPR143が、神経および非神経細胞（特にグリア細胞）においても発現していることを見出している。グリア細胞の中でも、ミクログリアが、PDに伴う炎症ならびに神経変性に関わることが示唆されていることから、ミクログリアにおけるGPR143のコンディショナルノックアウトマウスを作製し、MPTPによるドパミン神経変性の程度を野生型と比較解析する。
課題 Ⅲ) GPR143の情報伝達機構： GPR143とDA受容体D2Rとが、相互にどのドメインとの間で相互作用するのかをGPR143と類似の機能、構造を有するGPR37との間のキメラ変異体を作成して解析する。相互作用部位が決定された場合、この領域を含むペプチド配列が、GPR143とD2Rとの分子間相互作用ならびに機能的連関を阻害するかどうかを生化学的、行動学的指標を用いて解析する。
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