| 研究課題/領域番号 |
18H02590
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| 研究機関 | 熊本大学 |
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研究代表者 |
大槻 純男 熊本大学, 大学院生命科学研究部(薬), 教授 (60323036)
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| 研究分担者 |
伊藤 慎悟 熊本大学, 大学院生命科学研究部(薬), 准教授 (20466535)
増田 豪 熊本大学, 大学院生命科学研究部(薬), 助教 (70383940)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 脳関門 / 膜タンパク質 / 輸送 / プロテオミクス / 内在化 / DDS |
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| 研究実績の概要 |
本研究は、脳関門における中・高分子輸送システム群（マクロトランスポートソーム）の分子的全容を明らかにし、「中枢・末梢連関情報インターフェース」としての脳関門機能を明らかにすることを目的とする。さらに、脳関門マクロトランスポートソーム情報を活用し、脳関門を透過するキャリア同定を行う。平成30年度は脳関門モデル細胞の脳関門マクロトランスポートソームの解明のため表面ビオチン化法と定量プロテオミクスの最適化を実施し、プロテオームデータから細胞表面タンパク質や内在化タンパク質を抽出する条件を決定した。さらに、ヒト脳毛細血管内皮細胞株及び比較対象のヒト臍帯静脈内皮細胞を用いて解析を行い、各フラクションにビオチン化タンパク質が検出できることを確認し、ビオチン化タンパク質を生成しLC-MS/MSで解析することによって各フラクションのプロテオームデータを取得した。脳関門モデル細胞を透過する環状ペプチドを同定するために、環状ペプチドを提示するファージライブラリとヒト脳関門モデルのトランスウェル培養系を用い透過するファージを回収し、3回繰り返すことによって脳関門透過環状ペプチドが濃縮されていると考えられるフラクションを回収した。回収フラクション内のペプチドに相当するcDNAをシークエンスによって同定し、候補環状ペプチドを複数同定した。透過能を確認するために候補環状ペプチドを提示するファージをクローン化し、ヒト脳関門モデルの透過実験を実施した結果、時間依存的なファージの透過が確認できた。したがって、ヒト脳関門モデル細胞のファージ透過を促進する環状ペプチドを同定した。さらに、環状ペプチドを提示するファージは共培養系によるサル、ラット脳関門モデル細胞を時間依存的に透過した。また、同定環状ペプチドは脳関門モデル細胞の細胞生存率と密着結合を変化させないことが明らかになった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
脳関門モデル細胞の脳関門マクロトランスポートソームの解明は当初予定通り進行している。脳関門透過環状ペプチドは種差を越えて透過するか、また、細胞間隙の拡散を上昇させて透過するかが懸念材料であったが、種差を越えて透過し、細胞間隙の拡散は上昇させずに細胞を透過している結果を得られたため、最初の関門をこえることができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
脳関門モデル細胞の脳関門マクロトランスポートソームは設定したクライテリアと得られたプロテオームデータを解析し、予定通り検証を実施する。脳関門透過環状ペプチドに関してはin vivoの検討を開始するとともに透過機構の解析を行う。
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