| 研究実績の概要 |
前年度までに、細胞膜リン脂質の非対称性の樹立・維持に関与するフリッパーゼについての生化学的特性を解析した。具体的に細胞内膜系に局在するP4-ATPase (ATP8A1, ATP9A, ATP9B, ATP10B, ATP11B)にFLAGタグを付加し、HEK293細胞に発現させ、抗FLAG抗体を用いて精製、試験管内でPtdSerを基質としたATPase活性を評価し、ATP8A1とATP1BにPtdSerに依存的なATPase活性の上昇が確認された。そこで、細胞膜フリッパーゼとATP8A1とATP11Bを全て欠損させTlymphoma
株を樹立した。フリッパーゼ多重欠損細胞の細胞膜リン脂質の非対称性を解析したところ、定常状態において、多重欠損細胞がPtdSerを露出しないことが明らかとなった。それでは、この多重欠損細胞はどのように、細胞膜リン脂質の非対称性を樹立・維持しているのであろうか。本年度は、この多重フリッパーゼ欠損細胞を用いてCRISPR-Cas9ゲノムワイドスクリーニングを行った。多重欠損細胞に、約2万遺伝子を標的にしたsgRNAをコードしたレトロウイルスを感染させ、遺伝子をランダムに破壊した。ついで、細胞表面のPtdSerの露出を解析し、細胞膜のPtdSerの非対称分布が崩壊した細胞を濃縮、次世代シークエンスで解析した。その結果、一つの膜タンパク質をPtdSerの非対称性を維持する必須の分子であることを見出した。今後、この分子がどのように細胞膜のPtdSerの非対称分布を制御しているかを明らかにする。
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