スフィンゴ糖脂質と膜分子との複合体による細胞膜と微小環境のシグナル制御機構の解明

2018 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 18H02628
• 研究機関: 中部大学
• 研究代表者: 古川 鋼一 中部大学, 生命健康科学部, 教授 (80211530)
• 研究分担者: 大海 雄介 中部大学, 生命健康科学部, 助手 (10584758) ; 古川 圭子 中部大学, 生命健康科学部, 教授 (50260732)
• 研究期間 (年度): 2018-04-01 – 2021-03-31
• キーワード: 脂質ラフト / スフィンゴ糖脂質 / ミクロドメイン / クラスター / 複合体 / セラミド

研究実績の概要

細胞膜の脂質ラフトの構造、形成、機能等には不明の点が多い。そこで、スフィンゴ糖脂質糖鎖に固有のミクロドメイン(脂質ラフト) の時空間の動的形成過程と機能を解明し、その会合分子との複合体による膜環境の制御機構の解明を目指した。
1.スフィンゴ糖脂質の糖鎖固有のミクロドメイン形成と機能解明のため、メラノーマ等の細胞株に対して、EMARS/MS(enzyme-mediated activation of radical sources/mass spectrometry)法を用いて、ガングリオシドGD2に会合する膜分子を同定した。小細胞肺癌ではグルタミン輸送分子ASCT-2を、メラノーマ細胞においては、接着受容体であるインテグリンβ１を同定した。さらに、 小細胞肺癌細胞やメラノーマ細胞の膜上でGD2とASCT-2あるいはインテグリンが共局在し会合することを明らかにした。ASCT-2阻害剤による肺癌細胞の増殖抑制や、抗GD2抗体の添加によるメラノーマ細胞の増殖、接着の抑制が示された。
2. 脂質ドメインの化学構造に基づくスフィンゴ糖脂質-認識分子複合体形成の制御機構を解析した。即ち、糖脂質のセラミドの大部分が水酸化型である大腸癌細胞株を用いて、水酸化に働く酵素遺伝子、DES2及びFA2Hのノックアウトを行い、脂質修飾細胞株における糖脂質のラフト局在につき親株と比較検討した。水酸基除去細胞では、ガングリオシドGD3が脂質ラフトに局在することが判明した。
3. 細胞膜の脂質ラフトと細胞外顆粒との物理・化学的性状と機能連関の解析として、同定されている糖脂質会合膜分子の含量を検討し、GD3発現によるインテグリン含量の亢進を認めた。また、methyl -β-cyclodextrin 処理後の分泌顆粒の質/量の比較検討を行い、ラフト破壊細胞における著明な分泌顆粒の減少を明らかにした。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

脂質ラフト形成の時空間の動的プロセスの解明を目指して、細胞膜上のミクロドメインで糖脂質と会合する膜分子の同定を試み、ほぼ順調に興味ふかい分子が同定され、さらに、癌形質における役割が具体的に明らかになりつつあることから、期待にそった結果と考えられる。また、脂質ラフトの形成における糖脂質の脂質部位、セラミドの役割に関しても、脂質修飾酵素の遺伝子ノックアウトにより、解りやすい結果が得られたことは、今後のさらなる展開が期待できる。

今後の研究の推進方策

まず、EMARS/MSのアプローチが順調に展開しそうなので、当初予定していた、①様々な糖鎖に対する抗体を用いて、糖脂質との会合分子を広範に同定していく。②種々の刺激直後の脂質ラフト形成の過程を分子集簇現象と捉え、分間隔でEMARS/MS解析を行うことで、各糖脂質の周囲にクラスター形成する分子プロファイルを解析する。③実験動物に形成した腫瘍組織の切片でEMARS/MS解析を行い、細胞実験の結果と比較する。
さらに、糖脂質のセラミド部位の修飾に関わる酵素遺伝子ノックアウト細胞株を用いて、①EMARS/MS解析による脂質ラフトの変異の全体像の解明、②大腸癌などの手術標本における糖脂質水酸化の制御とその腫瘍生物学的な意義を解明する。③これらの所見を、蛍光標識糖脂質と超高解像イメージングにより詳細に観察して、さらなる洞察を得る。
脂質ラフトの形成と構築が、細胞外分泌顆粒の形成、分泌にいかに反映されるかにつき、エクソソーム形成の初期段階における脂質ラフトの役割を検討する。さらに、エクソソーム上の分子複合体の性状の生化学的およびイメージング法による解析を行い、細胞外分泌小胞の形成と分泌における脂質ラフト並びにスフィンゴ糖脂質の役割を明らかにする。
これらの成果をふまえて、脂質ラフトの制御技術、細胞外分泌小胞の癌微小環境や癌転移における具体的な役割を、in vitro、in vivo の実験により明らかにすることで、その治療応用に繋げる予定である。

研究成果

• [雑誌論文] Loss of enzyme activity of mutated B4GALNT1 gene products found in patients with hereditary spastic paraplegia induces relatively mild neurological disorders: Similarity with phenotypes of B4galnt1 knockout mice (2019)
  • 著者名/発表者名: Robiul H. Bhuiyan, Yuhsuke Ohmi, Yuki Ohkawa, Pu Zhang, Maiko Takano, Noboru Hashimoto, Tetsuya Okajima, Keiko Furukawa and Koichi Furukawa
  • 雑誌名: Neuroscience 巻: 397 ページ: 94-106
  • DOI: 10.1016/j.neuroscience.2018.11.034
  • 査読あり
• [雑誌論文] New era of research on cancer-associated glycosphingolipids (2019)
  • 著者名/発表者名: Koichi Furukawa, Yusuke Ohmi, Yuki Ohkawa, Robiul H. Bhuiyan, Pu Zhang, Orie Tajima, Noboru Hashimoto, Kazunori Hamamura, Keiko Furukawa
  • 雑誌名: Cancer Sci. 巻: 110 ページ: 1544-1551
  • DOI: 10.1111/cas.14005
  • 査読あり
• [雑誌論文] Roles of GalNAc-disialyl Lactotetraosyl Antigens in Renal Cancer Cells (2018)
  • 著者名/発表者名: Akiko Tsuchida, Motohiro Senda, Akihiro Ito, Seiichi Saito, Makoto Kiso, Takayuki Ando, Anne Harduin-Lepers, Akio Matsuda, Keiko Furukawa, Koichi Furukawa
  • 雑誌名: Sci. Rep. 巻: 8 ページ: 7017
  • DOI: 10.1038/s41598-018-25521-6
  • 査読あり
• [雑誌論文] Enhancement of malignant properties of human glioma cells by ganglioside GD3/GD2 (2018)
  • 著者名/発表者名: Taiji Iwasawa, Pu Zhang, Yuki Ohkawa, Hiroyuki Momota, Toshihiko Wakabayashi, Yuhsuke Ohmi, Robiul H. Bhuiyan, Keiko Furukawa, Koichi Furukawa
  • 雑誌名: Int. J. Oncol. 巻: 52 ページ: 1255-1266
  • DOI: 10.3892/ijo.2018.4266
  • 査読あり
• [雑誌論文] ASCT2 defined by enzyme-mediated activation of radical sources enhances malignancy of GD2-plus small cell lung cancer (2018)
  • 著者名/発表者名: Nobutoshi Esaki, Yuki Ohkawa, Noboru Hashimoto, Yuhsuke Tsuda, Yuhsuke Ohmi, Robiul H. Bhuiyan, Norihiro Kotani, Koichi Honke, Atsushi Enomoto, Masahide Takahashi, Keiko Furukawa, Koichi Furukawa
  • 雑誌名: Cancer Sci. 巻: 109 ページ: 141-153
  • DOI: 10.1111/cas.13448
  • 査読あり
• [雑誌論文] Lactosylceramide synthase, encoded by β4-galactosylteransferase-5 and -6, is pivotal for neuronal generation and myelin formation in mice (2018)
  • 著者名/発表者名: Toru Yoshihara, Hiroyuki Satake, Toshikazu Nishie, Nozomu Okino, Toshihisa Hatta, Hiroki Otani, Hiroshi Suzuki, Kazushi Sugihara, Eikichi Kamimura, Noriyo Tokuda, Keiko Furukawa, Koichi Fururkawa, Makoto Ito, and Masahide Asano
  • 雑誌名: Plos Genetics 巻: 14 ページ: e1007545
  • DOI: org/10.1371/journal.pgen
  • 査読あり
• [雑誌論文] Gangliosides in inflammation and neurodegeneration (2018)
  • 著者名/発表者名: Furukawa K, Ohmi Y, Tajima O, Ohkawa Y, Kondo Y, Shuting J, Hashimoto N, Furukawa K
  • 雑誌名: Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 巻: 156 ページ: 265-287
  • DOI: 10.1016/bs.pmbts.2018.01.009
  • 査読あり
• [雑誌論文] Site-1 protease deficiency causes human skeletal dysplasia due to defective inter-organelle protein trafficking (2018)
  • 著者名/発表者名: Kondo, Y., Fu, J., Wang, H., Hoover, C., McDaniel, M., Steet, R., Patra, D., Song, J., Pollard, J., Cathey, S., Yago, T., Wiley, G., Macwana, S., Guthridge, J., McGee, S., Li, S., Griffin, C., Furukawa, K., James, J.A., Ruan, C., McEver, R.P., Wierenga, K., Gaffney, P., Xia, L.
  • 雑誌名: J Clin Invest Insight 巻: 3 ページ: pii: 121596
  • DOI: 10.1172/jci.insight.121596
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Genome-wide CRISPR screens for Shiga toxins and Ricin reveal Golgi proteins critical for glycosylation (2018)
  • 著者名/発表者名: Songhai Tian, Khaja Muneeruddin, Mei Yuk Choi, Liang Tao, Robiul H. Bhuiyan, Yuhsuke Ohmi, Keiko Furukawa, Koichi Furukawa, Sebastian Boland, Scott A. Shaffer, Rosalyn M. Adams, Min Dong
  • 雑誌名: PLoS Biol. 巻: 16 ページ: e2006951
  • DOI: 10.1371/journal.pbio.2006951
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Differential roles of gangliosides in malignant properties of melanomas (2018)
  • 著者名/発表者名: Ohmi Y, Kambe M, Ohkawa Y, Hamamura K, Tajima O, Takeuchi R, Furukawa K, Furukawa K
  • 雑誌名: PLOS One 巻: 13 ページ: e0206881
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0206881
  • 査読あり
• [雑誌論文] Anti-GD2 CAR T cells could prove transformative for H3-K27M+ diffuse midline gliomas (2018)
  • 著者名/発表者名: Koichi Furukawa, Yuhsuke Ohmi, Keiko Furukawa
  • 雑誌名: Translational Cancer Research 巻: 8 ページ: S87-S93
  • DOI: 10.21037/tcr.2018.08.21
  • 査読あり
• [学会発表] Ig上のシアル酸機能の解析とSALSA法によるマウス脳組織のシアル化糖鎖構造解析 (2018)
  • 著者名/発表者名: 大海 雄介, 古川 鋼一
  • 学会等名: 第37回 日本糖質学会年会
  • 招待講演
• [学会発表] 糖鎖改変に伴う肝脂肪蓄積抑制の分子メカニズム (2018)
  • 著者名/発表者名: 田島 織絵, 古川 圭子, 古川 鋼一
  • 学会等名: 第91回日本生化学会大会
• [学会発表] 癌関連スフィンゴ糖脂質による細胞動態の分別的制御に関するタイムラプス解析 (2018)
  • 著者名/発表者名: 古川 圭子, 神戸 真理子, 大海 雄介, 大川 祐樹, 竹内 理香, 田島 織絵, 安藤 弘宗, 古川 鋼一
  • 学会等名: 第91回日本生化学会大会
• [学会発表] 癌転移におけるエクソソームの役割の解析 (2018)
  • 著者名/発表者名: 児玉 佳輝, 章 青, 大海 雄介, Hasan Bhuiyan Robiul, Yesmin Farhana, 山本 聡子, 古川 圭子, 古川 鋼一
  • 学会等名: 第91回日本生化学会大会
• [学会発表] グリオーマーの微小環境調節におけるガングリオシドGD3の役割 (2018)
  • 著者名/発表者名: 張 璞, 大川 祐樹, 大海 雄介, Robiul H.Bhuiyan, 加藤 彰, 古川 圭子, 岡島 徹也, 若林 俊彦, 古川 鋼一
  • 学会等名: 第77回 日本癌学会学術総会
• [学会発表] 癌関連ガングリオシド合成酵素遺伝子の発現制御機構シグナルの解析：シグナル伝達阻害剤による検討 (2018)
  • 著者名/発表者名: 竹内 理香, 宮田麻衣子, ウプル ジャヤデワン, 田島 織絵, 神戸 真理子, 古川 鋼一, 古川 圭子
  • 学会等名: 第77回 日本癌学会学術総会
• [学会発表] 糖鎖リモデリング癌細胞由来エキソソームの膜分子組成と分泌機構の解析 (2018)
  • 著者名/発表者名: 小林 伊織, 大海 雄介, 古川 圭子, ブイヤン ロビウル, 張 璞, 古川 鋼一
  • 学会等名: 第77回 日本癌学会学術総会
• [学会発表] Roles of asialo-series ganglioside GD1alpha in human cancer cell lines (2018)
  • 著者名/発表者名: Robiul H.Bhuiyan, Yuji Kondo, Yuki Ohkawa, Yuhsuke Ohmi, Pu Zhand, Tetsuya Okajima, Keiko Furukawa, Koichi Furukawa
  • 学会等名: 第77回 日本癌学会学術総会