| 研究課題/領域番号 |
18H02639
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
三好 弘之 京都大学, 医学研究科, 准教授 (30362479)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | スフェロイド / 組織幹細胞 / がん幹細胞 / Wnt |
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| 研究実績の概要 |
(I)正常組織アイデンティティを特定するエピジェネティック修飾の同定
当該年度は、ATAC-seq解析で最も近縁であったマウス膵臓と肝臓の幹細胞スフェロイドに注目して解析を行った。ATAC-seq解析で見出した膵臓特異的転写因子を発現するレンチウイルスベクターを作製し、肝臓上皮スフェロイドに感染させたが、安定的な発現が得られなかった。この問題を解決するために一過性発現系の効率を改善した（後述）。
(II)正常幹細胞の腫瘍化を誘導するエピジェネティック修飾の同定
我々の保有するヒト大腸がんスフェロイドライブラリーの中からWnt活性型とWnt不活性型のそれぞれ2株を選択し、ATAC-seq解析を行ったところ、それぞれのグループに特異的なビークを複数確認した。次に、Wnt活性型とWnt不活性型の大腸がん発生メカニズムを解析するため、活性化型beta-cateninを発現するマウス大腸上皮スフェロイドと、BRAF(V600E)変異を持つヒト大腸上皮スフェロイドを作製した。これらのスフェロイドがATAC-seqや発現解析で見出された候補遺伝子により、Wnt非依存的な増殖を引き起こすかどうかを調べる予定である。
(III)スフェロイド実験技術の改良
(I) (II)の研究を進めるにあたり生じた技術的問題を解決した。まず、ヒト大腸がんスフェロイドのATAC-seq解析で起きたゲノムDNAの混入を解決するため、酵素処理したスフェロイドから単一細胞のみを分離する方法を開発した。この処理により、バックグラウンドの少ない高品質の解析データが得られた。また、外来遺伝子の一過性発現実験をスフェロイドで行うため、簡便な遺伝子導入法を開発した。これにより、従来のトランスフェクション試薬を用いて約30%の導入効率が得られた。さらにCRISPRを用いた変異導入の効率も改善された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
当該年度は当初計画を遂行するにあたって発生したいくつかの技術的な問題を解決するための検討を行った結果、進捗に遅延が生じた。
まず、スフェロイドへの遺伝子導入は本研究において重要な技術であるが、従来の組換えレンチウイルスを用いた方法では導入遺伝子が発現しない事例が見られたことから、プラスミドを用いた一過性発現系を改良した。報告ではスフェロイド/オルガノイドへの核酸導入はエレクトロポレーション法が最も高効率であるが、機器が高価であり実験操作にも経験が必要である。そこで、従来の脂質ベースのトランスフェクション試薬を用いたプロトコールを再検討し、1%以下の導入効率が30%にまで改善した。さらにCRISPRを用いた遺伝子改変も安定的に可能となった。項目(I)の正常組織アイデンティティを特定するエピジェネティック修飾の同定については当該年度の計画である肝臓から膵臓への分化転換の実証までには至らなかったが、今後本技術を用いて遂行予定である。
また、項目(II)の正常幹細胞の腫瘍化を誘導するエピジェネティック修飾の同定において、ヒト大腸がんスフェロイドのATAC-seq解析を遂行するに当たり問題が生じた。マウススフェロイドで成功しているサンプル調整法を用いたところ、ゲノムDNAの混入により解析可能な結果が得られなかった。これは酵素処理の際にヒト由来スフェロイドがマウス由来スフェロイドに比べて分散しにくいため、比較的大きな細胞塊に死細胞由来のDNAが除去できないことに起因すると考えられた。この問題を解決するためにサンプル調整方法を検討したため、ATAC-seqは高品質のデータが得られたが、当該年度の予定であった腫瘍特異的エンハンサーの解析や細胞のがん化に必要な遺伝子の同定までに至らなかった。これら未達成の項目については次年度に解析を進める予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
(I)正常組織アイデンティティを特定するエピジェネティック修飾の同定
当該年度に改善したスフェロイドへの一過性遺伝子発現系を用いて、膵臓上皮のアイデンティティを規定すると考えられる候補遺伝子を肝臓上皮スフェロイドに発現させ、永続的な分化転換が起きるかどうかを検討する。また、幹細胞の分化転換が終末分化に影響を及ぼすかどうかを免疫不全マウスへの移植実験で確認する。
(II)正常幹細胞の腫瘍化を誘導するエピジェネティック修飾の同定
Wnt活性型と不活性型の大腸がんでそれぞれ特異的に見られるオープンクロマチン領域が制御する遺伝子を同定する。この際、新たな大腸がんスフェロイド株が得られれば追加でATAC-seq解析を行い、エピジェネティック修飾の差異をより精密に検出する。Wnt活性型大腸がんの発生メカニズムを解明するために、活性化型βカテニンを発現するマウス大腸正常上皮スフェロイドにATAC-seq解析より見出した候補遺伝子を強制発現させる。Wnt不活性型大腸がんについては、活性化型BRAFを発現するヒト正常大腸上皮スフェロイドを用いて同様の解析を行う。これらのスフェロイドの腫瘍性獲得の判定は、Wntリガンド非依存性増殖の可否によって行う。
次年度は新型コロナウイルス流行の影響のため、計画通り進まない可能性がある。特に、動物実験が制限されているため、本年度前半までに状況が改善されない場合はin vitroの実験で可能な限り対応する。研究室での実験も制限される場合は、項目(II)を優先して行う。
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