研究課題
本申請研究では、１：LCVのリソソームへの輸送回避機構の解明、２：LCVの小胞体への輸送機構の解明、３：レジオネラの小胞体定着機構の解明の３点のテーマを柱としている。そこで、当該年度の研究実施計画をテーマごとに以下に記載する。１：LCVのリソソームへの輸送回避機構の解明当該年度の解析により、Rab5のユビキチン化を惹起するレジオネラエフェクターを含む遺伝子群であるisland7の中から、データベース解析によりE3ユビキチンライゲース様のレジオネラエフェクターを見いだした。そして、その中の一つのエフェクターを発現させるとRab5のユビキチン化が促進されること、当該エフェクターの遺伝子破壊によりレジオネラ感染によるRab5のユビキチン化が抑制されることを見いだした。２：LCVの小胞体への輸送機構の解明これまでの解析により、Rab33BをLCVへと供給するレジオネラエフェクターがisland7に含まれている可能性を見出していた。そこで、当該年度はisland7にコードされる全てのレジオネラエフェクターをクローニングし、各々のエフェクターとRab33Bとの結合及び局在を解析した。その結果、２つのレジオネラエフェクターがRab33Bと特異的に結合すること、Rab33Bの局在を自身が局在する領域へと変化させることを見いだした。３：レジオネラの小胞体定着機構の解明当該年度の解析により、滑面小胞体と粗面小胞体を循環する宿主タンパク質であるBap31がLCVへと供給されること、またBap31を発現抑制すると小胞体に到達したLCVが粗面小胞体へと以降することができず、滑面小胞体に留まったままであることを見いだした。更に、粗面小胞体にスペースを作り出す因子のclimp-63を発現抑制するとレジオネラ増殖が有意に抑制されることも見いだした。
2: おおむね順調に進展している
本申請研究は、申請時に計画したプラン通り順調に進展していると考えている。理由は以下に記載する。本申請研究は３本の柱（１：LCVのリソソーム輸送回避機構の解明、２：LCVの小胞体への輸送機構の解明、３：レジオネラの小胞体定着機構の解明）を軸として行ってきた。まず、研究計画１と２に関しては、各々の機構を制御するレジオネラエフェエクターの候補分子が同定できたことは、極めて重要な進展であったと考えている。レジオネラエフェクターを同定できたことから、レジオネラが当該ツールを用いて「どのように」機能の制御を行っているのかの詳細を明らかにできることが期待される。また、研究計画３に関しては、小胞体に到達したレジオネラが滑面小胞体から粗面小胞体へと以降する際に利用する宿主因子が同定できたことが大きな進展だと考えている。当該因子が同定できたことにより、次は本因子を制御するレジオネラエフェクターを同定することに重点を置くことができ、本因子を制御するレジオネラエフェクターが明らかとなれば、レジオネラが滑面小胞体から粗面小胞体へと以降する分子機構の全容解明が期待される。
本申請研究の今後の推進方策をテーマ毎に以下に記載する。１：LCVのリソソームへの輸送回避機構の解明では、当該エフェクターの遺伝子欠損株を作製し、本遺伝子の欠損ががレジオネラ感染によるRab5のユビキチン化に与える影響やレジオネラの増殖に及ぼす影響を解析する。また、当該遺伝子のE3ライゲース活性に重要なアミノ酸残基の同定を目指す。これらの解析により、レジオネラによるリソソームへの輸送回避機構の詳細が明らかになることが期待される。２：LCVの小胞体への輸送機構の解明では、当該レジオネラエフェクターの遺伝子破壊株（single及びdouble）を作製し、本株を含むLCVへのRab33bの供給やERへの到達状況を解析する。また、これらのレジオネラエフェクターのRab33bに対する活性も調べる。これらの解析により、リモデリングを完了したLCVが小胞体へと移行する分子基盤の詳細が明らかになることが期待される。３：レジオネラの小胞体定着機構の解明では、Bap31の機能を制御するレジオネラエフェクターの探索及びclimp-63の機能を制御するレジオネラエフェクターの探索を引き続き行う。本解析により、小胞体に到達したレジオネラが、どのように滑面小胞体から粗面小胞体へと以降し、粗面小胞体で増殖する分子基盤が明らかになることが期待される。
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