| 研究課題/領域番号 |
18H02656
|
|---|
| 研究機関 | 東京薬科大学 |
|---|
研究代表者 |
新崎 恒平 東京薬科大学, 生命科学部, 准教授 (70609990)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
|
| キーワード | レジオネラ / レジオネラエフェクター / Rabタンパク質 / 細胞内小胞輸送 / 小胞体 |
|---|
| 研究実績の概要 |
本申請研究では、以下に示す３点のテーマを柱としている。そこで、当該年度の研究実施計画をテーマごとに記載する。
１：LCVのリソソームへの輸送回避機構の解明：当該年度の解析により、レジオネラによるRab5のユビキチン化の種類がK63チェーンによって媒介されるユビキチン化であることを見出した。また、Rab5は不活性化型（GDP型）と活性化型（GTP型）をサイクルする分子であるが、レジオネラは活性化型のRab5を特異的にユビキチン化していることを見出した。
２：LCVの小胞体への輸送機構の解明：昨年度の解析により同定したRab33bの局在を制御するレジオネラエフェクターの遺伝子破壊株を用いた感染実験を行い、当該レジオネラエフェクターを欠損させたレジオネラを含むLCV上に供給さえるRab33bの割合が野生型のレジオネラと比較して有意に減少することを見出した。また、本欠損株ではLCVの小胞体への到達に著しい遅延を示した。
３：レジオネラの小胞体定着機構の解明：当該年度の解析により、滑面小胞体と粗面小胞体を循環するBap31と結合するレジオネラエフェクターを同定し、本レジオネラエフェクターの遺伝子破壊によりLCVに集積するBap31が減弱することを見出した。また、本遺伝子破壊株を含むLCVは滑面小胞体から粗面小胞体への移行が抑制されていることも明らかにしている。また、レジオネラは小胞体内において効率良く増殖する際に宿主細胞のclimp-63を利用する。ハエにはclimp-63の遺伝子が存在せず、ハエ由来の細胞にヒト由来のclimp-63を発現させることで、レジオネラ増殖におけるclimp-63の重要性を示すことができると考えた。当該年度は、ハエ由来の細胞であるS2細胞の培養系の確立とヒトclimp-63を発現できるハエ発現ベクターの構築まで完了した。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本申請研究は、申請時に計画したプラン通り順調に進展していると考えている。理由は以下に記載する。
本申請研究は３本の柱（１：LCVのリソソーム輸送回避機構の解明、２：LCVの小胞体への輸送機構の解明、３：レジオネラの小胞体定着機構の解明）を軸として行ってきた。まず、研究計画１に関してはレジオネラ感染に伴うRab5のユビキチン化の詳細が分かってきた。ユビキチン化には大きく二つの機構（分解とシグナル）が存在するが、レジオネラはシグナルに寄与するユビキチン化をRab5に行っていることを見出した。更に、このユビキチン化は活性型（GTP型）のRab5に特異的であることを見出せたことも今後の解析に有意義な情報となる。また、２と３に関しては各々の経路に関与するレジオネラエフェクターが同定できたことが極めて重要な進捗であった。Rab33bをLCVへとリクルートするプロセスに必要なレジオネラエフェクターとBap31の機能を制御するレジオネラエフェクターの同定まで成功したことから、今後はこれらのレジオネラエフェクターが標的分子をどのように制御しているのかを解析することで、これらの事象の詳細な分子メカニズムの解明に繋げられることが強く期待される。
|
| 今後の研究の推進方策 |
本申請研究の今後の推進方策をテーマ毎に以下に記載する。
１：LCVのリソソームへの輸送回避機構の解明では、レジオネラによってユビキチン化されたRab5の機能的影響を評価する。レジオネラはK63チェーンによるRab5のユビキチン化を惹起するが、通常K63チェーンはシグナルに寄与するユビキチン化である。そこで、K63ユビキチン化されたRab5の挙動を解析する。また、ユビキチン化されるRab5のアミノ酸部位の同定も行い当該アミノ酸を変異させたRab5の発現がレジオネラ感染に及ぼす影響も評価する。
２：LCVの小胞体への輸送機構の解明では、Rab33bをLCVへとリクルートするレジオネラエフェクターのRab33bに対する活性（GDF活性やGEF活性）を生化学的手法により解析する。また、何らかの活性が見いだせたら、その活性に重要となるアミノ酸の同定及び活性を失った変異体の作製を行う。活性不活型変異体を発現させたレジオネラの感染実験により、本レジオネラエフェクターのRab33bに対する活性のレジオネラ感染における重要性を示すことができる。
３：レジオネラの小胞体定着機構の解明では、Bap31と結合しBap31をLCVに集積させるレジオネラエフェクターの具体的な役割を解析する。レジオネラから分泌された当該レジオネラエフェクターの局在や分泌のタイミングなどを評価する。また、ハエ由来の細胞（S2細胞）にヒトclimp-63を発現させ、その細胞にレジオネラを感染させ増殖への影響を評価する。もし、通常のS2細胞よりもヒトclimp-63を発現しているS2細胞でレジオネラの増殖亢進が見られれば、レジオネラ増殖におけるclimp-63の重要性を強く証明できる。
|
