| 研究課題/領域番号 |
18H02677
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| 研究機関 | 国立研究開発法人国立がん研究センター |
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研究代表者 |
高阪 真路 国立研究開発法人国立がん研究センター, 研究所, 主任研究員 (00627119)
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| 研究分担者 |
椨 康一 東京医科歯科大学, 難治疾患研究所, 助教 (10466469)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 融合遺伝子 / 肉腫 / 機能解析 |
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| 研究実績の概要 |
肉腫関連融合遺伝子の配列情報をデータベースより取得し, クローニングを行い, 約100種類の融合遺伝子の発現ベクターを構築した. マウス線維芽細胞である3T3細胞にレトロウイルスを用いて融合遺伝子を導入し, 3T3 focus formation assay及びmixed all nominated mutants in one method (MANO法)でのcell growth competition assayを行い, 各アッセイ系での融合遺伝子のがん化能を評価した. 3T3細胞においてがん化能が評価できなかった融合遺伝子については, C2C12マウス筋芽細胞及びマウス間葉系幹細胞に遺伝子導入し, 機能評価を行った. 分化誘導培地を用いて分化誘導を行い, 融合遺伝子の分化抑制機能を評価した. また, バイオマテリアルや培養条件を選択し, MANO法での細胞数変化を定量し, 評価に適した培養系を確立した. 更にトランスフォームしたがん細胞のみが生存可能なバイオマテリアルスクリーニングを行った. がん化を確認できた融合遺伝子を3T3細胞, C2C12細胞に導入したisogenicモデルで, 異なる蛍光蛋白質でラベルした親株とがん化株をポリマースライド上に播種し, 比較セルアレイを実施した. がん化株のみあるいは親株のみが有意に増殖・接着する合成ポリマーを蛍光イメージングにより抽出した.
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
これまでに約100種類の融合遺伝子の機能解析を行った. 機能評価予定の肉腫関連融合遺伝子のクローニングを行い, 必要なコンストラクトを構築した. マウス線維芽細胞である3T3細胞に融合遺伝子を導入し, 3T3 focus formation assay及びmixed all nominated mutants in one method (MANO法)でのcell growth competition assayを行いこのアッセイ系でのがん化能を評価した. 3T3細胞においてがん化能が評価できなかった融合遺伝子についてはC2C12マウス筋芽細胞及びマウス間葉系幹細胞に遺伝子導入し, 分化誘導培地やバイオマテリアルを選択し分化誘導を行い, MANO法での細胞数変化を定量し, 融合遺伝子の分化抑制機能を評価すると共に評価に適した培養系を確立した. 更にトランスフォームしたがん細胞のみが生存可能なバイオマテリアル探索を行った. がん化を確認できた融合遺伝子を3T3細胞, C2C12細胞に導入したisogenicモデルで, 異なる蛍光蛋白質でラベルした親株とがん化株をポリマースライド上に播種し, 比較セルアレイを実施した. がん化株のみが有意に増殖・接着する合成ポリマーを蛍光イメージングにより抽出した.
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| 今後の研究の推進方策 |
これまでに構築した約100種類の融合遺伝子コンストラクトを用いて, 3T3マウス線維芽細胞, C2C12マウス筋芽細胞, マウス間葉系幹細胞からのisogenic細胞株を構築し, 細胞株からRNA-seqを行い, 各融合遺伝子が発現制御する特異的な遺伝子発現パターンを比較し, 100種類の融合遺伝子のクラスタリング解析を行う. さらに, Gene Set Enrichment Analysis (GSEA)により各融合遺伝子の特徴となる発現遺伝子群やシグナルパスウェイを同定しクラスターごとに分子標的を絞り込み, 約20種類の候補分子標的薬の選定を行う. それらの薬剤投与実験を行いmixed all nominated mutants in one method (MANO法)で評価することで, 融合遺伝子特異的に作用する分子標的薬の候補を同定する. また融合遺伝子が導入されたトランスフォーム細胞のみが生存可能なバイオマテリアル探索を引き続き実施し, 候補となったバイオマテリアルの検証実験を行う.
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