| 研究課題/領域番号 |
18H02683
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| 研究機関 | 熊本大学 |
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研究代表者 |
山口 知也 熊本大学, 大学院先導機構, 准教授 (70452191)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 癌細胞 / カベオラ / エンドサイトーシス / ROR1 / 細胞膜 / カベオリン / 生体膜ダイナミクス / メンブレントラフィック |
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| 研究実績の概要 |
リネジ生存癌遺伝子であるTTF-1によって転写活性化される受容体型チロシンキナーゼであるROR1は、「カベオラ」と呼ばれる生体膜ドメインの形成に関与することで、肺腺癌における重要な生存シグナルを担っている。そこで本研究では、これまで多くの謎に包まれてきた生体膜でのカベオラの詳細な生成過程や生理機能、更にはカベオラに規定される生存・増殖シグナリングの区画化など、癌細胞での生体膜における規則性や多様性、或はこれまでにない制御機構の発見を目的とした。今年度は、受容体としてのROR1の新たな機能に着目し、重要なカベオラ機能の１つであるカベオラ依存的なエンドサイトーシス制御機構におけるROR1による詳細な分子機序の解明を行った。これまでの解析から、ROR1はカベオラ形成に関わるCAVIN1以外にCAVIN3とも結合し、CAVIN2とは結合しないという、非常に特異性を持った相互作用を示すことが分かった。また、肺腺癌細胞における内因性のROR1とCAVIN3は一部において細胞膜、および細胞質で共局在を示すことが分かり、細胞膜でのカベオラが集積している領域においてもROR1とCAVIN3は共局在していることが分かった。さらに、超高解像度共焦点レーザー顕微鏡を用いた解析から、ROR1とCAVIN3の共局在はアクチンフィラメント上に存在していることが判明した。次に、CAVIN3が結合するROR1の結合領域の同定を行った。様々なROR1の機能的なドメインを欠失させたROR1変異体を作製し、これらの変異体とCAVIN3を発現させることで免疫沈降を行った結果、CAVIN3はROR1のキナーゼドメイン内のN末から1/3の領域と相互作用することが分かり、これまで分かっていたCAVIN1やCAV1が結合する領域とは別の部位でCAVIN3はROR1と結合していることが判明した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成30年度は、当初の研究実施計画の通り、概ね順調に進展した。これまでの結果から、肺腺癌細胞においてROR1はCAVIN3タンパク質と相互作用することで、カベオラ依存的なエンドサイトーシスの制御に関与する可能性が明らかになりつつある。つまり、肺腺癌細胞ではROR1はCAV1、CAVIN1、CAVIN3というカベオラ関連分子とそれぞれ異なる領域で相互作用することで、カベオラ形成とカベオラ依存的なエンドサイトーシスに関与している可能性が考えられた。これまでの解析から、CAVIN3が相互作用するROR1の結合領域が明らかとなったため、現在、ROR1のCAVIN3が結合する領域を欠損させたROR1欠損変異体を作製し、肺腺癌細胞に発現させることでこの結合領域が与えるカベオラ依存的なエンドサイトーシスへの影響について検討を行っている。内因性のROR1の発現の影響を抑えるために、発現させる野生型のROR1、およびCAVIN3が結合できない欠損変異体のROR1にはsilent mutation（siROR1に対する抵抗性）を加えたコンストラクトを作製し、細胞に発現させた後、siROR1処理を行い、内因性のROR1の発現を抑制させる実験系を構築した。これまでの予備的検討から、カベオラ依存的なエンドサイトーシスの指標にはコレラトキシンのサブユニットBに蛍光標識させたもの（CTB-488）を用い、細胞内への取り込みについて評価を行った結果、野生型のROR1を発現させた細胞では細胞内にCTB-488の取り込みが観察されるのに対して、CAVIN3が結合できないROR1欠損変異体を発現させた細胞では、CTB-488が細胞膜に留まり、細胞内への取り込みが阻害される傾向にあることを見出している。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまでの解析から、ROR1はCAVIN1以外にカベオラ依存的なエンドサイトーシスへの関与が示唆されるCAVIN3とも結合することが分かってきた。そこで、来年度は、CAVIN3の結合部位を欠損したROR1結合部位欠損変異体を用いて、さらに詳細にエンドサイトーシスへの影響について検討を行う。具体的には、蛍光を標識したコレラトキシンを用いてマルチウェルアレイスキャン装置により評価を行うとともに、ルテニウムレッドやCT-B-HRPを利用した電子顕微鏡による解析を行う。これまでの結果からROR1はキナーゼ活性も有していることから、ROR1を介したカベオラ依存的なエンドサイトーシスにキナーゼ活性が必要かどうかについても検討する必要がある。さらに、エンドサイトーシスにより生成される小胞の細胞内移動にはCAVIN3の調節下にあるミオシン関連蛋白質が関与していることから、それら蛋白質とROR1との相互作用についても詳細に解析を行う予定である。次に、エンドサイトーシスにより細胞内に形成される初期エンドソームにおける細胞内でのPI3K-AKT伝達経路に代表されるような重要な生存シグナルを制御するシグナリングエンドソームとしての機能や、細胞膜上に存在するEGFR等の受容体のターンオーバーを制御するリサイクリングエンドソームとしての機能に着目し、同様にCAVIN3蛋白質の結合部位を欠損したROR1欠損変異体を用いることで、生存シグナルへの影響や膜・小胞による細胞内輸送ネットワークへの影響について調べる。また、ROR1によって制御されたエンドソーム上においてAKTの活性化が起きていることを、スクロース濃度勾配遠心法により細胞内から特異的にエンドソームを抽出してくることで、生化学的アプローチによってもAKTの活性化がROR1によるカベオラ依存的なエンドサイトーシスによって制御されることを証明する。
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