進行期神経芽腫に対するＫＩＲリガンド不一致臍帯血移植における分子学的基盤の解析

2018 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 18H02690
• 研究機関: 名古屋大学
• 研究代表者: 高橋 義行 名古屋大学, 医学系研究科, 教授 (40432273)
• 研究分担者: 門松 健治 名古屋大学, 医学系研究科, 教授 (80204519) ; 上條 岳彦 埼玉県立がんセンター(臨床腫瘍研究所), 臨床腫瘍研究所, 所長 (90262708)
• 研究期間 (年度): 2018-04-01 – 2021-03-31
• キーワード: 神経芽腫 / がん免疫 / PDX

研究実績の概要

＜神経芽腫患者由来腫瘍を用いた異種移植（Patient-derived Tumor Xenograft, PDXモデルの作成＞神経芽腫患者から採取された微少な腫瘍検体をNSGマウスなどの超免疫不全マウスに移植して初代マウス（F0）を作成した。同時に腫瘍検体からゲノムDNAとRNAを抽出して遺伝子発現情報や遺伝子変異、染色体のコピー数などの遺伝情報を取得する。移植後に腫瘍体積の増大が確認されたマウスから腫瘍を摘出し、次世代のマウス（F1,F2,F3）を作成する。最終的に3回以上の継代を経て得られた腫瘍組織の遺伝情報を取得し、患者由来の腫瘍検体から得られた遺伝情報との同一性を検証することでPDXモデルの樹立を確認できた。平成30年度に3例の患者検体から受理が可能であった。
＜KIRリガンド不一致CBTを行った腫瘍の分子学的基盤の解析＞
神経芽腫の予後因子である染色体コピー数（11qLOH, 1p lossなど）をアレイCGH およびSNPアレイで解析する。MYCN遺伝子のFISH (Fluorescence in situ Hybridization)法による増幅判定、DNA量をPI（Propidium Iodide）による核酸染色と、FACSによる含有量解析によってDNA ploidy解析などを行い、アロ反応性NK細胞を利用した新規免疫療法が、既存の予後因子とどのような相関があるのか解析している。
＜ＧＤ２を標的としたキメラ抗原受容体遺伝子導入Ｔ細胞（CAR-T)の作成＞非ウイルスベクターであるpiggyBacトランスポゾン法を用いた遺伝子導入技術により神経芽腫細胞表面に存在するＧＤ２を標的としたモノクローナル抗体を遺伝子導入してキメラ抗原受容体遺伝子導入Ｔ細胞（CAR-T)を作成した。GD2.CAR-T細胞のデザインを最適化するために、上記のＰＤＸモデルを用いて検証する。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

＜神経芽腫患者由来腫瘍を用いた異種移植（Patient-derived Tumor Xenograft, PDXモデルの作成＞神経芽腫患者から採取された微少な腫瘍検体をNSGマウスなどの超免疫不全マウスに移植して初代マウス（F0）を作成した。同時に腫瘍検体からゲノムDNAとRNAを抽出して遺伝子発現情報や遺伝子変異、染色体のコピー数などの遺伝情報を取得する。移植後に腫瘍体積の増大が確認されたマウスから腫瘍を摘出し、次世代のマウス（F1,F2,F3）を作成する。最終的に3回以上の継代を経て得られた腫瘍組織の遺伝情報を取得し、患者由来の腫瘍検体から得られた遺伝情報との同一性を検証することでPDXモデルの樹立を確認できた。平成30年度に3例の患者検体から受理が可能であった。
＜KIRリガンド不一致CBTを行った腫瘍の分子学的基盤の解析＞
神経芽腫の予後因子である染色体コピー数（11qLOH, 1p lossなど）をアレイCGH およびSNPアレイで解析する。MYCN遺伝子のFISH (Fluorescence in situ Hybridization)法による増幅判定、DNA量をPI（Propidium Iodide）による核酸染色と、FACSによる含有量解析によってDNA ploidy解析などを行い、アロ反応性NK細胞を利用した新規免疫療法が、既存の予後因子とどのような相関があるのか解析している。
＜ＧＤ２を標的としたキメラ抗原受容体遺伝子導入Ｔ細胞（CAR-T)の作成＞非ウイルスベクターであるpiggyBacトランスポゾン法を用いた遺伝子導入技術により神経芽腫細胞表面に存在するＧＤ２を標的としたモノクローナル抗体を遺伝子導入してキメラ抗原受容体遺伝子導入Ｔ細胞（CAR-T)を作成した。GD2.CAR-T細胞のデザインを最適化するために、上記のＰＤＸモデルを用いて検証する。

今後の研究の推進方策

＜神経芽腫患者由来腫瘍を用いた異種移植（Patient-derived Tumor Xenograft, PDXモデル）の継続＞
平成30年度に確立できたPDX1モデルを、臨床検体を用いて継続する。神経芽腫患者から採取された微少な腫瘍検体をNSGマウスなどの超免疫不全マウスに移植して初代マウス（F0）を作成する。同時に腫瘍検体からゲノムDNAとRNAを抽出して遺伝子発現情報や遺伝子変異、染色体のコピー数などの遺伝情報を取得する。移植後に腫瘍体積の増大が確認されたマウスから腫瘍を摘出し、次世代のマウス（F1,F2,F3）を作成する。最終的に3回以上の継代を経て得られた腫瘍組織の遺伝情報を取得し、患者由来の腫瘍検体から得られた遺伝情報との同一性を検証することでPDXモデルの樹立を確認し複数の患者から樹立する。
＜KIRリガンド不一致CBTを行った腫瘍の分子学的基盤の解析＞神経芽腫の予後因子である染色体コピー数（11qLOH, 1p lossなど）をアレイCGH およびSNPアレイで解析する。MYCN遺伝子のFISH (Fluorescence in situ Hybridization)法による増幅判定、DNA 量をPI（Propidium Iodide）による核酸染色と、FACSによる含有量解析によってDNA ploidy解析などを行い、アロ反応性NK細胞を利用した新規免疫療法が、既存の予後因子とどのような相関があるのか検討する。
＜ＧＤ２を標的としたキメラ抗原受容体遺伝子導入Ｔ細胞（CAR-T)の作成＞非ウイルスベクターであるpiggyBacトランスポゾン法を用いた遺伝子導入技術により神経芽腫細胞表面に存在するＧＤ２を標的としたモノクローナル抗体を遺伝子導入してキメラ抗原受容体遺伝子導入Ｔ細胞（CAR-T)を作成し、最適化するためにＰＤＸモデルで検証し臨床研究の基盤研究を進める。

研究成果

• [雑誌論文] MYCN de novo gain-of-function mutation in a patient with a novel megalencephaly syndrome (2018)
  • 著者名/発表者名: Kato Kohji、Miya Fuyuki、Hamada Nanako、Negishi Yutaka、Narumi-Kishimoto Yoko、Ozawa Hiroshi、Ito Hidenori、Hori Ikumi、Hattori Ayako、Okamoto Nobuhiko、Kato Mitsuhiro、Tsunoda Tatsuhiko、Kanemura Yonehiro、Kosaki Kenjiro、Takahashi Yoshiyuki、Nagata Koh-ichi、Saitoh Shinji
  • 雑誌名: Journal of Medical Genetics 巻: なし ページ: jmedgenet-2018
  • DOI: 10.1136/jmedgenet-2018-105487
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Integration Mapping of piggyBac-Mediated CD19 Chimeric Antigen Receptor T Cells Analyzed by Novel Tagmentation-Assisted PCR (2018)
  • 著者名/発表者名: Hamada Motoharu、Nishio Nobuhiro、Okuno Yusuke、Suzuki Satoshi、Kawashima Nozomu、Muramatsu Hideki、Tsubota Shoma、Wilson Matthew H.、Morita Daisuke、Kataoka Shinsuke、Ichikawa Daisuke、Murakami Norihiro、Taniguchi Rieko、Suzuki Kyogo、Kojima Daiei、Kojima Seiji、Nakazawa Yozo、Takahashi Yoshiyuki、et al
  • 雑誌名: EBioMedicine 巻: 34 ページ: 18～26
  • DOI: 10.1016/j.ebiom.2018.07.008
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Integrated molecular profiling of juvenile myelomonocytic leukemia (2018)
  • 著者名/発表者名: Murakami Norihiro、Okuno Yusuke、Yoshida Kenichi、Shiraishi Yuichi、Nagae Genta、Suzuki Kyogo、Narita Atsushi、Sakaguchi Hirotoshi、Kawashima Nozomu、Wang Xinan、Xu Yinyan、Chiba Kenichi、Tanaka Hiroko、Hama Asahito、Sanada Masashi、Kojima Seiji、Ogawa Seishi、Takahashi Yoshiyuki、Muramatsu Hideki、et al
  • 雑誌名: Blood 巻: 131 ページ: 1576～1586
  • DOI: 10.1182/blood-2017-07-798157
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] Clinical trial of KIR-ligand incompatible allogeneic cord blood transplantation reduces relapse of bone marrow in children with primary high risk stage 4 neuroblastoma. (2019)
  • 著者名/発表者名: Yoshiyuki Takahashi.
  • 学会等名: 第41回造血細胞移植学会総会
  • 招待講演
• [学会発表] Evalution of complication in cord blood transplantation from KIR ligand incompatible donor. (2019)
  • 著者名/発表者名: Atsushi Narita, Shunsuke Miwata, Kotaro Narita, Hironobu Kitazawa, Shinsuke Kataoaka, Motoharu Hamada, Rieko Taniguchi, Daisuke Ichikawa, Norihiro Murakami, Kyogo Suzuki, Eri Nishikawa, Nozomu Kawashima, Yusuke Okuno, Hideki Muramatsu, Nobuhiro Nishio, Seiji Kojima, Yoshinori Ito, Takahahsi Yoshiyuki.
  • 学会等名: 第41回造血細胞移植学会総会
• [学会発表] KIR-ligand incompatible allogeneic cord blood transplantation for relapsed stage 4 neuroblastoma in a multicenter trial. (2018)
  • 著者名/発表者名: Kataoka S, Nishio N, Arakawa Y, Kakuda H, Kuroda H, Ito E, Hyakuna N, Kobayashi M, Takahashi Y.
  • 学会等名: Advandces in Neutroblastoma Reseah Association
  • 国際学会
• [学会発表] 再発4期神経芽腫に対するKIRリガンド不一致同種臍帯血移植の多施設共同研究による治療成績 (2018)
  • 著者名/発表者名: 片岡伸介, 西尾信博, 荒川ゆうき, 角田治美, 黒田啓史, 伊藤悦朗, 百名伸之, 小林正夫, 高橋義行
  • 学会等名: 第10回血液疾患免疫療法学会学術集会（SIHDS 2018）
• [学会発表] 骨髄MRDの消失は神経芽腫に対するKIRリガンド不一致同種臍帯血移植後の移植片対腫瘍効果を示唆する (2018)
  • 著者名/発表者名: Nobuhiro Nishio, Shinsuke Kataoka, Shunsuke Miwata, Kotaro Narita, Hironobu Kitazawa, Motoharu Hamada, Daisuke Ichikawa, Rieko Taniguchi, Norihiro Murakami, Kyogo Suzuki, Nozomu Kawashima, Eri Nishikawa, Yusuke Okuno, Atsushi Narita, Hideki Muramatsu, Seiji Kojima, Yoshiyuki Takahashi.
  • 学会等名: 第60回日本小児血液・がん学会学術集会