進行期神経芽腫に対するＫＩＲリガンド不一致臍帯血移植における分子学的基盤の解析

2019 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 18H02690
• 研究機関: 名古屋大学
• 研究代表者: 高橋 義行 名古屋大学, 医学系研究科, 教授 (40432273)
• 研究分担者: 門松 健治 名古屋大学, 医学系研究科, 教授 (80204519) ; 上條 岳彦 埼玉県立がんセンター(臨床腫瘍研究所), 臨床腫瘍研究所, 所長 (90262708)
• 研究期間 (年度): 2018-04-01 – 2021-03-31
• キーワード: 神経芽腫 / がん免疫 / PDX

研究実績の概要

＜神経芽腫患者由来腫瘍を用いた異種移植（Patient-derived Tumor Xenograft, PDXモデルの作成＞
神経芽腫患者から採取された微少な腫瘍検体を超免疫不全マウス（NSGマウス）に移植して初代マウス（F0）を作成した。同時に腫瘍検体からゲノムDNAとRNAを抽出して遺伝子発現情報や遺伝子変異、染色体のコピー数などの遺伝情報を取得する。移植後に腫瘍体積の増大が確認されたマウスから腫瘍を摘出し、次世代のマウス（F1,F2,F3）を作成する。最終的に3回以上の継代を経て得られた腫瘍組織の遺伝情報を取得し、患者由来の腫瘍検体から得られた遺伝情報との同一性を検証することでPDXモデルの樹立を確認できた。これまで10例の患者検体から3例のPDXライブラリが樹立している。
＜KIRリガンド不一致CBTを行った腫瘍の分子学的基盤の解析＞
神経芽腫の予後因子である染色体コピー数（11qLOH, 1p lossなど）をアレイCGH およびSNPアレイで解析する。MYCN遺伝子のFISH (Fluorescence in situ Hybridization)法による増幅判定、DNA量をPI（Propidium Iodide）による核酸染色と、FACSによる含有量解析によってDNA ploidy解析などを行い、新規がん免疫療法の予後因子を解析している。
＜GD2を標的としたキメラ抗原受容体遺伝子導入Ｔ細胞（CAR-T)の作成＞
非ウイルスベクターであるpiggyBacトランスポゾン法を用いた遺伝子導入技術により神経芽腫細胞表面に存在するGD2を標的としたモノクローナル抗体を遺伝子導入してキメラ抗原受容体遺伝子導入Ｔ細胞（CAR-T)を作成し、既存の神経芽腫細胞株に対する細胞傷害活性を確認できた。GD2.CAR-T細胞のデザインを最適化するために、上記のPDXモデルを用いて検証する。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

＜神経芽腫患者由来腫瘍を用いた異種移植（Patient-derived Tumor Xenograft, PDXモデルの作成＞
神経芽腫患者から採取された微少な腫瘍検体を超免疫不全マウス（NSGマウス）に移植して初代マウス（F0）を作成した。同時に腫瘍検体からゲノムDNAとRNAを抽出して遺伝子発現情報や遺伝子変異、染色体のコピー数などの遺伝情報を取得する。移植後に腫瘍体積の増大が確認されたマウスから腫瘍を摘出し、次世代のマウス（F1,F2,F3）を作成する。最終的に3回以上の継代を経て得られた腫瘍組織の遺伝情報を取得し、患者由来の腫瘍検体から得られた遺伝情報との同一性を検証することでPDXモデルの樹立を確認できた。これまで10例の患者検体から3例のPDXライブラリが樹立している。
＜KIRリガンド不一致CBTを行った腫瘍の分子学的基盤の解析＞
神経芽腫の予後因子である染色体コピー数（11qLOH, 1p lossなど）をアレイCGH およびSNPアレイで解析する。MYCN遺伝子のFISH (Fluorescence in situ Hybridization)法による増幅判定、DNA量をPI（Propidium Iodide）による核酸染色と、FACSによる含有量解析によってDNA ploidy解析などを行い、新規がん免疫療法の予後因子を解析している。
＜GD2を標的としたキメラ抗原受容体遺伝子導入Ｔ細胞（CAR-T)の作成＞
非ウイルスベクターであるpiggyBacトランスポゾン法を用いた遺伝子導入技術により神経芽腫細胞表面に存在するGD2を標的としたモノクローナル抗体を遺伝子導入してキメラ抗原受容体遺伝子導入Ｔ細胞（CAR-T)を作成し、既存の神経芽腫細胞株に対する細胞傷害活性を確認できた。GD2.CAR-T細胞のデザインを最適化するために、上記のＰＤＸモデルを用いて検証する。

今後の研究の推進方策

＜神経芽腫患者由来腫瘍を用いた異種移植（Patient-derived Tumor Xenograft, PDXモデル）の継続＞
引き続き確立できたPDXモデルを、臨床検体を用いて継続する。神経芽腫患者から採取された微少な腫瘍検体をNSGマウスなどの超免疫不全マウスに移植して初代マウス（F0）を作成する。同時に腫瘍検体からゲノムDNAとRNAを抽出して遺伝子発現情報や遺伝子変異、染色体のコピー数などの遺伝情報を取得する。移植後に腫瘍体積の増大が確認されたマウスから腫瘍を摘出し、次世代のマウス（F1,F2,F3）を作成する。最終的に3回以上の継代を経て得られた腫瘍組織の遺伝情報を取得し、患者由来の腫瘍検体から得られた遺伝情報との同一性を検証することでPDXモデルの樹立を確認し複数の患者から樹立する。
＜KIRリガンド不一致CBTを行った腫瘍の分子学的基盤の解析＞
神経芽腫の予後因子である染色体コピー数（11qLOH, 1p lossなど）をアレイCGH およびSNPアレイで解析する。MYCN遺伝子のFISH (Fluorescence in situ Hybridization)法による増幅判定、DNA 量をPI（Propidium Iodide）による核酸染色と、FACSによる含有量解析によってDNA ploidy解析などを行い、新規がん免疫療法の予後因子を解析する。
＜GD2を標的としたキメラ抗原受容体遺伝子導入Ｔ細胞（CAR-T)の作成＞
非ウイルスベクターであるpiggyBacトランスポゾン法を用いた遺伝子導入技術により神経芽腫細胞表面に存在するGD2を標的としたモノクローナル抗体を遺伝子導入してキメラ抗原受容体遺伝子導入Ｔ細胞（CAR-T)を作成し、最適化するためにPDXモデルで検証し臨床研究の基盤研究を進める。

研究成果

• [雑誌論文] Association between graft source and response to live-attenuated vaccination in pediatric hematopoietic stem cell transplantation recipients: a single-center retrospective study. (2020)
  • 著者名/発表者名: Suzuki T, Kawada JI, Nishikawa E, Torii Y, Horiba K, Takeuchi S, Okumura T, Muramatsu H, Takahashi Y, Ito Y
  • 雑誌名: Bone Marrow Transplant 巻: - ページ: -
  • DOI: 10.1038/s41409-020-0867-8
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Autologous Stem Cell Transplantation for Children With Renal Tumors, and Adults With Wilms Tumor: Retrospective Analysis of the Japanese Transplant Registry Unified Management Program. (2020)
  • 著者名/発表者名: Kobayashi R, Inoue M, Takahashi Y, Kikuta A, Ogawa A, Koga Y, Koh K, Hashii Y, Hara J, Kato K, Tabuchi K, Matsumoto K
  • 雑誌名: J Pediatr Hematol Oncol 巻: - ページ: -
  • DOI: 10.1097/MPH.0000000000001779
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] MYCN de novo gain-of-function mutation in a patient with a novel megalencephaly syndrome. (2019)
  • 著者名/発表者名: Kato K, Miya F, Hamada N, Negishi Y, Narumi-Kishimoto Y, Ozawa H, Ito H, Hori I, Hattori A, Okamoto N, Kato M, Tsunoda T, Kanemura Y, Kosaki K, Takahashi Y, Nagata KI, Saitoh S
  • 雑誌名: J Med Genet 巻: 56 ページ: 388-395
  • DOI: 10.1136/jmedgenet-2018-105487
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Clinical Outcomes after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplantation in Children with Juvenile Myelomonocytic Leukemia: A Report from the Japan Society for Hematopoietic Cell Transplantation. (2019)
  • 著者名/発表者名: Yoshida N, Sakaguchi H, Yabe M, Hasegawa D, Hama A, Hasegawa D, Kato M, Noguchi M, Terui K, Takahashi Y, Cho Y, Sato M, Koh K, Kakuda H, Shimada H, Hashii Y, Sato A, Kato K, Atsuta Y, Watanabe K; Pediatric Myelodysplastic Syndrome Working Group of the Japan Society for Hematopoietic Cell Transplantation.
  • 雑誌名: Biol Blood Marrow Transplant 巻: S1083-8791 ページ: 30835-3
  • DOI: 10.1016/j.bbmt.2019.11.029
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Human herpesvirus-6B infection in pediatric allogenic hematopoietic stem cell transplant patients: Risk factors and encephalitis. (2019)
  • 著者名/発表者名: Miura H, Kawamura Y, Hattori F, Tanaka M, Kudo K, Ihira M, Yatsuya H, Takahashi Y, Kojima S, Sakaguchi H, Yoshida N, Hama A, Yoshikawa T
  • 雑誌名: Transpl Infect Dis 巻: 22 ページ: e13203
  • DOI: 10.1111/tid.13203
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] 非ウイルスベクター法を用いたキメラ抗原受容体遺伝子導入Ｔ細胞（CAR-T 細胞）療法の現状と展望 (2019)
  • 著者名/発表者名: 高橋義行
  • 学会等名: 第30回日本医学会総会2019中部
  • 招待講演
• [学会発表] 転移性高リスク神経芽腫に対するがん免疫療法の最前線 (2019)
  • 著者名/発表者名: 高橋義行
  • 学会等名: 第68回神奈川小児腫瘍研究会
  • 招待講演
• [学会発表] PiggyBac transposon mediated gene modified T cell therapy for cost-effective therapeutic platform against cancer (2019)
  • 著者名/発表者名: Yoshiyuki Takahashi
  • 学会等名: 第57回日本癌治療学会学術集会
  • 招待講演
• [学会発表] CAR-T細胞療法の基礎と臨床 (2019)
  • 著者名/発表者名: 高橋義行
  • 学会等名: 第61回日本小児血液・がん学会学術集会
  • 招待講演
• [学会発表] Chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy with non-virus vector system (2019)
  • 著者名/発表者名: Yoshiyuki Takahashi
  • 学会等名: Insights in Hematology conference 2019
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] がん治療の最前線 CAR-T細胞療法 (2019)
  • 著者名/発表者名: 高橋義行
  • 学会等名: 第30回日本医療薬学会年会
  • 招待講演
• [学会発表] 急性リンパ性白血病に対する非ウイルスベクター法を用いたCAR-T細胞療法の開発 (2019)
  • 著者名/発表者名: 高橋義行
  • 学会等名: 第78回日本癌学会学術総会
  • 招待講演