| 研究課題/領域番号 |
18H02698
|
|---|
| 研究機関 | 藤田医科大学 |
|---|
研究代表者 |
鈴木 元 藤田医科大学, 医学部, 教授 (80236017)
|
|---|
| 研究分担者 |
水谷 泰嘉 藤田医科大学, 医学部, 助教 (10546229)
竹内 俊幸 藤田医科大学, 医学部, 助教 (20538483)
村手 隆 中部大学, 生命健康科学部, 教授 (30239537)
安藤 隆幸 静岡県環境衛生科学研究所, 医薬食品部, 主査 (40402226)
新美 敦子 藤田医科大学, 医学部, 准教授 (50508984)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2022-03-31
|
| キーワード | 肺癌 / 転移 / スフィンゴ脂質 / セラミド / アクチン |
|---|
| 研究実績の概要 |
１）肺癌細胞株A549細胞より細胞抽出液を調整し、抗CERS6抗体を用いて免疫沈降を行った。沈降物中にCERS6たんぱく質が含まれていることを確認したのち、これをSDS PAGEにて展開、切りだし、ゲル内消化、抽出、On line-nanoLC、MSMSによるタンパク質同定を名古屋大学トランスフォーマティブ生命分子研究所分子構造センターとの共同研究により行なった。この作業を３回行ったところ、主として３種類のたんぱく質(群)が繰り返し同定された。第１群はCERS6たんぱく質を含む各種CERSファミリータンパク質であり、この結果は沈降物中にCERS6たんぱく質を含むことを確認した予備実験結果、および、CERSファミリータンパク質がヘテロ複合体を作っているという既存の報告とよく一致していた。第２群はアクチンとの結合が報告されているタンパク質であり、本研究の目的であるCERS6制御下にある細胞骨格制御解明の糸口となる候補タンパク質である可能性が考えられた。第３群は細胞内シグナル伝達にかかわる主要タンパク質群であり、本解析を始めるにあたって予期していなかったタンパク質群であった。この結果の下、今後は第２群に含まれるアクチン結合たんぱく質に焦点を絞り、研究を展開することとした。
２）２クラスター目について新たに３９類縁体の活性評価を行ったところ、１２化合物で生化学的CERS6阻害活性を検出した。それらに対してさらに細胞毒性と細胞遊走能阻害を確認したところ、3化合物についてはがん細胞及び正常線維芽細胞に対して100uMの濃度にて毒性を認めず、また、0.4~2.4uM（EC50）の濃度で細胞遊走阻害を観察した。前年度までのスクリーニングでは１化合物が同様の結果を示していたことを合わせ、２つ目のクラスターはCERS6阻害活性を有すると結論付けた。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成３１/令和元年度の目的をほぼ達成している。１）ではCERS6下流に存在し、アクチン繊維と相互作用を有することが報告されているタンパク質候補を同定した。文献的にこのタンパク質のノックダウンによる表現型はCERS6ノックダウンによる表現型と類似しており、このタンパク質が本研究の目指すものである可能性が高いと考えている。2）では新たなクラスターを同定し、動物実験を実施する準備が整った。
|
| 今後の研究の推進方策 |
1 前年度に同定した下流エフェクタータンパク質候補の解析を進める。1-1 エフェクタータンパク質候補CERS6相互作用をWBにて確認する。1-2 相互作用が確認されたタンパク質につき、相互作用部位を同定する。1-3 エフェクタータンパク質候補のノックダウンを行い、転移にかかわる表現型に対する影響を調べる。
2 CERS6発現制御に関するプロモーター解析を実施する。
3 マウスを用いた実験的がん細胞転移系が、本研究の化合物評価系としても十分な信頼性を有するか否かの検討を行う。
|
