| 研究課題/領域番号 |
18H02715
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| 研究機関 | 東京医科歯科大学 |
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研究代表者 |
石川 欽也 東京医科歯科大学, 医学部附属病院, 教授 (30313240)
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| 研究分担者 |
柳原 大 東京大学, 大学院総合文化研究科, 教授 (90252725)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | RNA / 小脳 / Purkinje / タンパク / TDP-43 |
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| 研究実績の概要 |
RNAリピートとRNA結合蛋白は、遊離と結合をダイナミックに起こして平衡状態にあるが、SCA31ではUGGAA【RNA】が、ALSではTDP-43など【RNA結合蛋白】が、バランスを崩す方向に働いて発病すると考えられた。その証拠に、RNAとRNA結合蛋白のバランスを修復することでショウジョウバエでは病態が改善した。この知見に基づき、本研究ではまずモデルマウスでの表現型を確認し、そのうえでRNAとRNA結合蛋白のバランスの障害があることをRNA発現解析で確認する。さらに、バランス障害を補正して表現型が改善することを検証する目的で実施している。
当初、モデルマウスとして用いたSCA31-BAC Tgモデルマウスの表現型が軽微で、変異部分を人工的にさらに伸長させる必要性を考慮せざるをえなかった。しかし、人工的な変異部分の伸長は達成できず、加えて人為的な配列変更による異常伸長は、翻訳されるアミノ酸の変化をもたらすことが予想されたため、困難と判断せざるをえなかった。一方、その後の詳細なモデルマウスの行動解析から、モデルマウスが60週齢付近で高齢ではあるが異常をきたすことが判明した。このことから、本研究全体の到達すべき目標・マイルストーンを考慮して、モデルマウス作製への努力をRNA発現解析にシフトし、研究終了時点で達成すべき事項であった、RNAとRNA結合蛋白のバランスの崩壊が実際にマウスで認められるかを検証することにした。これまでのところ、モデルマウスにおけるRNA発現解析を一部実施するとともに、RNA結合蛋白であるTDP-43の欠損状態における小脳のRNA発現解析を実施した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
作製したSCA31モデルマウスの解析を行っている過程で、当初の予想に反し、マウスに十分な表現型が現れなかった。このためモデルマウスの妥当性検証のために期間を延長し、2019年度も引き続き検証した。また、マウスの表現型が軽いことなどから、原因部分のリピートを伸長させることができるかを検証した。このために遺伝子診断で最も伸長度が強い患者を選定し、その患者より同意を得て血液を採取し、外注によってリンパ芽球株を樹立した。次に、得られたゲノムDNAを用いて低温でクローニング用大腸菌を用いて伸長を試みたが、元の伸長よりさらに伸長を得ることはできなかった。内部配列を操作して安定的な伸長を得るなどの工夫もしたが、SCA31の配列が5塩基繰り返しで、さらにアミノ酸に翻訳されることなどから制限があり、伸長を樹立することができていない。
一方、これまでモデルマウスの歩行解析では週齢を追って解析し、明確な表現型を認めないと考えてきたが、週齢を追って解析することで、逆にモデルマウスにおける運動学習が起きて表現型を低く見積もってしまう可能性が、他のモデルマウスにおける異常を参考にしたところ着想された。このため週齢を追わずナイーブな条件において60週齢マウスを解析したところ、野生型に比較してSCA31-BAC Tgモデルマウスで歩行能力の低下を認め、小脳梗塞モデルマウスとの症候的な類似性も検出した（申請書内マイルストーン３達成）。以上より、リピートを過剰伸長させることが困難である現状からは、現有のモデルマウスを用いて解析することが妥当と考えた。
さらにSCA31におけるRNA結合蛋白TDP-43の病態寄与効果を検証する目的と、申請書マイルストーン４を達成する基礎データを集積する目的で、TDP-43の欠失マウスにおけるRNA発現解析を進めた。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまでの本疾患における研究で最も大きな障壁になっていることは、Tgマウスの症状が軽いことであったが、これまでの研究で表現型が認められる時期がおおよそ目安がついたため、この時期におけるSCA31-BAC TgモデルマウスでのRNA発現を最終年度で解析する。その結果を、RNA（UGGAAリピート）とRNA結合蛋白(TDP-43, FUS, hnRNPA2/B1など)のバランスの障害の観点から、これらの結合蛋白が関わる下流の遺伝子におけるスプライス異常を同定するため、さらに検証する。特にTDP-43については、TDP-43の欠失モデルにおいて行った、RNA-seqの結果から、TDP-43の発現量低下（SCA31のモデル状態と仮定）で見られるスプライス異常を見つけ、その遺伝子がSCA31-BAC Tgマウスで異常をきたしていないか検証する。また、研究の計画に掲げた、TDP-43分子をウイルスベクターによってUGGAAリピートを発現するSCA31-BAC Tgマウスに導入する試み（申請書内 マイルストーン６）は、SCA31-BAC Tgモデルマウスでの表現型確認が遅れたこともあり、達成が困難ではあるが、培養細胞レベルで部分TDP-43（RRMドメイン等）を導入することで、その基礎的研究成果を上げるべく研究を進める予定である。
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