| 研究課題/領域番号 |
18H02728
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| 研究機関 | 富山大学 |
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研究代表者 |
北島 勲 富山大学, 大学院医学薬学研究部(医学), 教授 (50214797)
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| 研究分担者 |
原田 健右 富山大学, 附属病院, 助教 (30436795)
柳原 克紀 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(医学系), 教授 (40315239)
仁井見 英樹 富山大学, 大学院医学薬学研究部(医学), 准教授 (50401865)
山本 善裕 富山大学, 大学院医学薬学研究部(医学), 教授 (70452844)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 敗血症 / 感染症 / 起炎菌迅速同定法 / 細菌数定量 / 敗血症バイオマーカー / NF-κB |
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| 研究実績の概要 |
敗血症検査総合システムの３つ構成①Melting Temperature(Tm)マッピング法、②血液中の細菌数定量測定法、③転写因子NF-κB活性量のハイスループット迅速測定法開発に関して各検査法の非臨床試験を行い、ほぼ完成に至った。最初のステップである検体のサンプリングに関しては、EDTA含血液検体から白血球吸着フィルターによりリンパ球を分離し高純度の核蛋白を抽出し、その残余血漿から遠心後ペレット中に存在する細菌のDNAを抽出するプロトコルを作成し、臨床検体を用いて精度を検証した。３つの構成に関しては、①Ｔｍマッピング法は、敗血症検体から菌種判定データベースを拡充しわが国の敗血症起炎菌をほぼ網羅できる200菌種を登録した。②血液中の細菌数定量検査法は、細菌16SリボソームDNAプライマーを作成し、１ｍｌ血液中に5万個大腸菌を内部相対対照として各細菌の16SリボソームDNA量をリアルタイムPCR法で測定するプロトコルを完成した。本プロコトコルを用いて富山大学附属病院にて敗血症症例における臨床検体の測定を開始しデータを蓄積している。③転写因子NF-κB活性量は、蛍光相関分光法による高感度測定法を完成させた。以上の測定法を統合し、富山大学附属病院検査輸血細胞治療部において、敗血症患者の臨床データ、細菌検査、白血球数、SOFA総スコア、CRP,IL-6値との照合を実施中である。国際的には、Tmマッピング法を中心に世界の大学.研究所にWeb publicationを行った。(A novel new method for identification of bacteria outpaces sepsis. Impact 12:52-54, 2018. DOI: https://doi.org/10.21820/23987073.2018.12.52)
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
当初の計画は、敗血症検査総合システムの３つ構成①Melting Temperature(Tm)マッピング法、②血液中の細菌数定量測定法、③転写因子NF-κB活性量のハイスループット迅速測定法開発に関してそれぞれの検査法開発までであった。検体のサンプリングに関し、EDTA含血液検体から白血球吸着フィルターによりリンパ球を分離し高純度の核蛋白を抽出し、その残余血漿から遠心後ペレット中に存在する細菌のDNAを抽出するプロトコルが完成し、３つ検査法は既に完成まで至っており、さらに臨床検体を用いた解析という次年度から行う次のステップまで進めることができた。とくに、富山大学附属病院検査輸血細胞治療部において、敗血症患者の臨床データ、細菌検査、白血球数、SOFA総スコア、CRP,IL-6値との照合を実施中であり、次年度計画した研究内容を前倒して遂行している。さらに国際的には、Tmマッピング法を中心に世界の大学と研究所にWeb publicationを2019年1月に配信した。
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| 今後の研究の推進方策 |
本研究の基盤となる３つの課題、①Melting Temperature (Tm)マッピング法、②転写因子NF-κB活性定量測定法、③血中の細菌定量検査法を昨年度の成果を基に非臨床検討から臨床研究へ展開する計画である。①Tmマッピング法は、成人の細菌由来敗血症同定法とそのデータベース化はほぼ完成したため、富山大学から多施設共同研究へ展開する。さらに少量の血液量しか得られない新生児の敗血症へも展開する。さらに、抗ガン薬使用者等で重篤となる「真菌由来の敗血症」に対応する検査システムを構築し臨床検討を行う。②NF-κB活性量から組織障害度を判定するための検証のために、生体侵襲度の高い手術（膵臓がん、食道がん、心臓）の周術期モニターを行う。③血中に存在する細菌数定昇検査は、大腸菌DNAコピー数あたりで菌数を換算する方法を昨年度まで採用していたが、全ての細菌にDNAが1コピーのみ存在する遺伝子を細菌データベースから網羅的に解析し探索する。引き続き、生体侵襲度のバイオマーカーとなるか臨床データと照合して検討を進める。細菌由来のDNAを用いた検査では、死菌由来のDNAを検出する欠点がある。そこで新たに、生菌細菌由来のATPのみを検出する検査法を開発し、血液中の細菌の生死を高感度かつ迅速に判定できる検査法開発に取り組む。
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