新規抗体改変技術を用いたがん特異的一本鎖抗体の作製とがん免疫療法への応用

2018 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 18H02839
• 研究機関: 愛媛大学
• 研究代表者: 安川 正貴 愛媛大学, プロテオサイエンスセンター, 教授 (60127917)
• 研究分担者: 越智 俊元 愛媛大学, 医学系研究科, 講師 (10571086)
• 研究期間 (年度): 2018-04-01 – 2021-03-31
• キーワード: がん免疫療法 / 遺伝子改変T細胞 / キメラ抗原受容体 / 一本鎖抗体ライブラリー / NY-ESO-1

研究実績の概要

我々は、新たながん免疫療法を確立する目的で、がん細胞で高発現されているHLA-A2/NY-ESO-1157複合体をがん免疫標的モデルとして、新たながん特異的一本鎖抗体(scFv)スクリーニング法を確立した。まず、4人の健常人ヒト末梢血B細胞を回収し、5’RACE PCR法を用いて免疫グロブリン軽鎖および重鎖可変領域遺伝子をドナー毎にクローニングした。次に、HLA-A*02:01/NY-ESO-1157 (A2/NY-ESO-1157)特異的抗体 (clone 3M4E5)を利用してscFvライブラリーを作製し、HLA-A2/NY-ESO-1157特異的scFvのスクリーニングを行なった。その結果、10種類以上の新規HLA-A2/NY-ESO-1157特異的scFvを短期間で同定できた。さらに、新たに同定したHLA-A2/NY-ESO-1157特異的scFvをchimeric antigen receptor (CAR)遺伝子に組み込み、CAR-T細胞を作製した。その結果、抗原特異性を維持しながら、様々な標的親和性と交差反応性を保持するscFvレパトアの獲得に成功した。また、このCAR-T細胞は様々ながん細胞を抗原特異的に殺傷することがin vitro実験系で確認された。さらに、ヒト腫瘍細胞移植免疫不全マウスを用いたin vivo実験系でも抗腫瘍効果が確認できた。以上のことから、本研究手法は様々ながん抗原特異的scFvレパトアの作製に応用が可能であると考えられる。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

健常人ヒト末梢血B細胞を回収し、5’RACE PCR法を用いて免疫グロブリン軽鎖および重鎖可変領域遺伝子をクローニングした。A2/NY-ESO-1157 scFv可変領域遺伝子の片方を可変領域ライブラリーに置換することで、A2/NY-ESO-1157 CARライブラリーを作成した。これらのCARライブラリーを末梢血T細胞に遺伝子導入して抗原特異的に刺激すると、A2/NY-ESO-1157特異的CAR-T細胞が増幅してくることをテトラマー法により見出した。続いて、A2/NY-ESO-1157 テトラマー陽性CAR-T細胞よりその可変領域遺伝子をクローニングしたところ、複数の新規A2/NY-ESO-1157特異的CAR遺伝子の同定に成功した。
次に、CAR遺伝子を　Jurkat 76細胞株に遺伝子導入した (J76/CAR)。J76/CAR細胞株をA2テトラマーで染色すると、A2/NY-ESO-1157テトラマーによって様々な強度で染色されることから、これらのscFvが異なる標的親和性を保持していることが明らかとなった。さらに、一部のJ76/CAR細胞株は、A2/NY-ESO-1157テトラマーにもA2/HIV Gag77テトラマーにも染色されたことから、scFv間で異なる交差反応性を保持していることも明らかとなった。

今後の研究の推進方策

本年度は昨年度の研究を発展させて、まず複数のドナーより健常人/患者B細胞を回収し、ドナー毎に免疫グロブリン可変領域遺伝子ライブラリーを作製して、CARライブラリーの拡大を図る。同時に、新たに同定した可変領域遺伝子を固定して、可変領域ライブラリーを活用しながら全く新しいA2/NY-ESO-1157特異的CARの同定に繋げる。さらに、新たに同定したA2/NY-ESO-1157特異的CARを末梢血T細胞に遺伝子導入する。A2/NY-ESO-1157テトラマーと各種サイトカイン解析により、内在性に発現するA2/NY-ESO-1157複合体を認識して腫瘍細胞を傷害することを確認する。また、NY-ESO-1157ペプチドのアミノ酸配列の一部をアラニンに置換して、同定したA2/NY-ESO-1157特異的CARが認識しうる類似ペプチドの探索を行い、正常細胞に対する潜在的交差反応性にも配慮することで安全性の担保に務める。このような解析を通して、臨床応用に最適なA2/NY-ESO-1157特異的CAR遺伝子の同定に繋げることを目標とする。
さらに本研究で得られた知見を、HLA/ペプチド複合体とは異なる抗原特異的CARにも応用する。具体的には、現在難治性B細胞性腫瘍で臨床試験が進められているCD19特異的CARを利用する。CD19 scFv可変領域遺伝子の片方を可変領域ライブラリーに置換して、新たなヒト型CD19-CARの同定に繋げて、本研究課題の汎用性を確認する。

研究成果

• [雑誌論文] Histone H3K27 Demethylase Negatively Controls the Memory Formation of Antigen-Stimulated CD8+ T Cells. (2019)
  • 著者名/発表者名: Yamada T, Nabe S, Toriyama K, Suzuki J, Inoue K, Imai Y, Shiraishi A, Takenaka K, Yasukawa M, Yamashita M.
  • 雑誌名: J Immunol. 巻: 202 ページ: 1088-1098
  • DOI: 10.4049/jimmunol.1801083
  • 査読あり
• [雑誌論文] Safe childbirth for a type 1 antithrombin-deficient woman with novel mutation in the SERPINC1 gene undergoing antithrombin concentrate therapy (2019)
  • 著者名/発表者名: Ikeda Y, Yamanouchi J, Hato T, Yasukawa M, Takenaka K.
  • 雑誌名: Blood Coagul Fibrinolysis 巻: 30 ページ: 47-51
  • DOI: 10.1097/MBC.0000000000000785.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Enhancing T cell receptor stability in rejuvenated iPSC-derived T cells improves their use in cancer immunotherapy (2018)
  • 著者名/発表者名: Minagawa A, Yoshikawa T, Yasukawa M, Hotta A, Kunitomo M, Iriguchi S, Takiguchi M, Kassai Y, Imai E, Yasui Y, Kawai Y, Zhang R, Uemura Y, Miyoshi H, Nakanishi M, Watanabe A, Hayashi A, Kawana K, Fujii T, Nakatsura T, Kaneko S.
  • 雑誌名: Cell Stem Cel 巻: 23 ページ: 850-858
  • DOI: 10.1016/j.stem.2018.10.005
  • 査読あり
• [雑誌論文] Association of platelet response to cilostazol with clinical outcome and CYP genotype in patients with cerebral infarction (2018)
  • 著者名/発表者名: Ikeda Y, Yamanouchi J, Kumon Y, Yasukawa M, Hato T.
  • 雑誌名: Thromb Res 巻: 172 ページ: 14-20
  • DOI: 10.1016/j.thromres.2018.10.003
  • 査読あり
• [雑誌論文] Reinforce the antitumor activity of CD8+ T cells via glutamine restriction (2018)
  • 著者名/発表者名: Nabe S, Yamada T, Suzuki J, Toriyama K, Yasuoka T, Kuwahara M, Shiraishi A, Takenaka K, Yasukawa M, and Yamashita M.
  • 雑誌名: Cancer Sci. 巻: 109 ページ: 3737-3750
  • DOI: 10.1111/cas.13827
  • 査読あり
• [雑誌論文] Development of an FVIII inhibitor in a mild hemophilia patient with a Phe595Cys mutation (2018)
  • 著者名/発表者名: Yamanouchi J, Tokumoto D, Ikeda Y, Maruta M, Kaneko M, Hato T, and Yasukawa M.
  • 雑誌名: Intern Med. 巻: 57 ページ: 3179-3182
  • DOI: 10.2169/internalmedicine.1145-18
  • 査読あり
• [雑誌論文] The tumor suppressor menin prevents effector CD8 T cell dysfunction via metabolic restriction by targeting mTOR activation (2018)
  • 著者名/発表者名: Suzuki J, Yamada T, Inoue K, Nabe S, Kuwahara M, Takemori N, Takemori A, Matsuda S, Makoto Kanoh M, Imai Y, Yasukawa M, and Yamashita M.
  • 雑誌名: Nat Commun. 巻: 9 ページ: 3296
  • DOI: 10.1038/s41467-018-05854-6
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] Development of anti-myeloma immunotherapy by exploiting modified antibodies specific for A2/NY-ESO-1 (2018)
  • 著者名/発表者名: 4)Ochi, T., Maruta, M., Tanimoto, K., Asai, H., Saitou, T., Yakushijin, Y., Fujiwara, H., Imamura,T., Takenaka, K., Yasukawa, M.
  • 学会等名: The fourth CRI-CIMT-EATI-AACR International Cancer Immunotherapy Conference
  • 国際学会
• [学会発表] A Heterozygous Mutation of G-Protein-Coupled Receptor 25 in a Family with Inherited Thrombocytopenia and Thrombosis (2018)
  • 著者名/発表者名: 5)Yamanouchi, J., Ikeda, Y., Hato, T., Yasukawa, M., Takenaka, K.
  • 学会等名: 60th ASH Annual Meeting
  • 国際学会
• [学会発表] Clinical Study on Favipiravir in Patients with Severe Fever with Thrombocytopenia Syndrome (2018)
  • 著者名/発表者名: Yasukawa, M.
  • 学会等名: Nikkei Asian Conference on Communicable Diseases 2018
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] グルタミン代謝抑制によるCD8+ T細胞の抗腫瘍活性増強メカニズム (2018)
  • 著者名/発表者名: 名部彰悟, 山田武司, 鈴木淳平, 山下政克, 安川正貴
  • 学会等名: 第22回がん免疫学会総会
• [学会発表] 改変抗体を用いた難治性骨髄腫に対する新規T細胞免疫療法の開発 (2018)
  • 著者名/発表者名: 丸田雅樹, 越智俊元, 谷本一史, 東太地, 齋藤卓, 藤原弘, 今村健志, 安川正貴
  • 学会等名: 第22回日本がん免疫学会総会
• [学会発表] 改変抗体を応用した難治性骨髄腫に対する新規T細胞免疫療法の開発 (2018)
  • 著者名/発表者名: 越智俊元, 丸田雅樹, 谷本一史, 朝井洋晶, 斉藤卓, 藤原弘, 今村健志, 竹中克斗, 安川正貴
  • 学会等名: 第10回血液疾患免疫療法学会学術集会
• [学会発表] 難治性骨髄腫を標的とした改変抗体T細胞免疫療法 (2018)
  • 著者名/発表者名: 丸田雅樹, 越智俊元, 谷本一史, 東太地, 斉藤卓, 藤原弘, 今村健志, 安川正貴
  • 学会等名: 第80回日本血液学会学術集会
• [備考] 愛媛大学大学院医学系研究科血液・免疫・感染症内科学
  • URL: https://www.m.ehime-u.ac.jp/school/int.med1/
• [産業財産権] CARライブラリ、scFvのスクリーニング方法、抗体またはその結合断片、キメラ抗原受容体、核酸、細胞、および細胞の製造方法 (2019)
  • 発明者名: 越智俊元、安川正貴、藤原 弘
  • 権利者名: 越智俊元、安川正貴、藤原 弘
  • 産業財産権種類: 特許
  • 産業財産権番号: 2019-018269