| 研究課題/領域番号 |
18H02855
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| 研究機関 | 大学共同利用機関法人高エネルギー加速器研究機構 |
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研究代表者 |
加藤 龍一 大学共同利用機関法人高エネルギー加速器研究機構, 物質構造科学研究所, 准教授 (50240833)
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| 研究分担者 |
小澤 龍彦 富山大学, 大学院医学薬学研究部(医学), 助教 (10432105)
正木 秀幸 近畿大学, 生物理工学部, 准教授 (90247982)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | フラビウイルス / ウエストナイルウイルス / 中和モノクローナル抗体 / Ｘ線結晶構造解析 |
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| 研究実績の概要 |
時に致死性の脳炎・髄膜炎を惹き起こすフラビウイルス科の蚊媒介性ヒト感染性ウイルスであるウエストナイルウイルス（WNV）は、世界の広い地域に分布している。我が国への感染拡大の危険性も指摘されているが、実用的な治療薬やワクチンはない。我々は抗 WNV E タンパク質モノクローナル抗体の抗原認識機構を明らかにし、その知見に基づき抗 WNV 薬の創薬を目指すための基盤研究を行っている。具体的には、新たに単離されたエピトープの異なる３種類のモノクローナル抗体と、WNV E タンパク質の複合体のＸ線結晶構造解析を進めている。
今年度は、まず、WNV E タンパク質およびそのモノクローナル抗体それぞれについて、発現と精製を行った。WNV E タンパク質は、全長を昆虫培養細胞で発現させ（近畿大学）、その培養上清（発現タンパク質を含む）から目的タンパク質を精製した（高エネ機構）。また、WNV E タンパク質の全長およびドメインごとの大腸菌発現コンストラクトを作成し、その発現と精製を行った（高エネ機構）。抗体については３種類のうち２種類について、安定発現細胞株を樹立しその発現と精製を行った（富山大学）。
得られた精製タンパク質は高エネ機構において、複合体の形成とその精製、複合体の結晶化を行った。サンプルの準備ができたものから実験を進め、培養細胞発現および大腸菌発現のWNV E タンパク質（全長）と１種類の抗体の組合せについて、複合体の結晶化スクリーニングを実施した。残念ながら現在のところ結晶を得る事はできていない。引き続き、結晶化スクリーニング条件範囲を広げての結晶化を行うと共に、ドメインで発現させたWNV E タンパク質および他の抗体との組合せについても結晶化スクリーニングを実施すべく準備を進めている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
WNV E タンパク質全長について、近畿大学において昆虫培養細胞を用いて発現させ、発現タンパク質を含む培養上清を高エネ機構で精製した。また、大腸菌を用いた発現系の検討を高エネ機構で行った。WNV E タンパク質の全長およびドメインごとの発現コンストラクトのデザインを行い、大腸菌発現用プラスミドに組み込んだ。これらを用いて大腸菌での発現条件の検討を行った。全長および第３ドメインで良好な発現条件が見出されたため、それらについてスケールアップしてさらに検討を行った。全長については、タンパク質を変性・再生しての精製方法の検討を行った。全長、第３ドメインとも精製を行うことができ、それらを結晶化実験に供した。
モノクローナル抗体については、富山大学において３種類のうち２種類について安定発現細胞株を樹立し、その発現と精製を行った。それらは高エネ機構での結晶化実験に供した。
これらの精製タンパク質を用いて、高エネ機構において複合体の形成とその単離を行い、結晶化ロボットを用いて複合体の結晶化スクリーニングを行った。まず、培養細胞発現および大腸菌発現のWNV E タンパク質（全長）と１種類の抗体の組合せについて、複合体の結晶化スクリーニングを実施した。残念ながらその組合せでは現在のところ結晶を得る事はできなかった。
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| 今後の研究の推進方策 |
結晶化スクリーニングを実施したが結晶が得られなかったWNV E タンパク質全長と１つの抗体の組合せについては、範囲を広げてさらに結晶化スクリーニングを実施する。また、ドメインで発現させたWNV E タンパク質および他の抗体についても、それぞれ大量発現および精製の準備ができつつあるので、サンプルの準備ができたものから順次結晶化スクリーニングを実施する。（高エネ機構）
昆虫培養細胞でのWNV E タンパク質の発現については、引き続きそのスケールアップと発現効率の向上を検討し、最終精製標品の量の向上をはかる（近畿大学）。モノクローナル抗体については、残り１つの安定発現株の樹立を進めると共に、３種類それぞれについて結晶化を行うために十分な量の精製サンプル供給を行う（富山大学）。
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